李倩昀　許守明　馬俊雅

摘要[目的]研究擬南芥SGR2基因參與葉綠素降解和衰老過(guò)程。[方法]購(gòu)得SGR2（stay green rice，水稻滯綠基因）基因的T-DNA插入突變體，并進(jìn)行葉綠素?zé)晒夥治?、葉綠素含量和可溶性總糖測(cè)定、qRT-PCR等試驗(yàn)以及生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]突變體葉綠素a含量較WT（colo-0野生型）降低；可溶性糖含量高于WT；RBCS（Rubisco，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亞基）和CAB（Chl a binding protein，葉綠素a結(jié)合蛋白）基因表達(dá)下調(diào)。而突變體開(kāi)花明顯比野生型延遲。[結(jié)論]證明了SGR2基因參與了擬南芥葉綠素降解和衰老過(guò)程。

關(guān)鍵詞滯綠；衰老；葉綠素降解；擬南芥

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0100-05

Arabidopsis thaliana SGR2 Genes Involved in Degradation and Senescence of Chlorophyll

LI Qianyun， XU Shouming，MA Junya（Key Laboratory of Plant Stress Biology，College of Life Sciences，Henan University， Kaifeng，Henan 475004）

Abstract[Objective]To study Arabidopsis thaliana SGR2 genes involved in degradation and senescence of chlorophyll.[Method] TDNA insertion mutants for SGR2 gene were got.The experiments of chlorophyll fluorescence analysis，determination of the content of chlorophyll and soluble sugar，qRT PCR test and some other bioinformatics analysis were conducted.[Result]The chlorophyll content of the mutant leaves was less than the case in the wildtype.The soluble sugar content of the mutant leaves was more than the case in the wildtype.Expression of RBCS and CAB were down regulated.While，a transparently prolonged flowering period was observed in mutant，as compared with colo0.[Conclusion]The results demonstrate that SGR2 gene is involved degradation and senescence of chlorophyll in A.thaliana.

Key wordsStaygreen； Senescence；Chlorophyll degradation；Arabidopsis thaliana

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1304303）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃（2014GGJS-029）。

作者簡(jiǎn)介李倩昀（1992—），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向：植物遺傳學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物分子生物學(xué)研究。

收稿日期2017-12-04

植物衰老一般指植物的一個(gè)器官或整個(gè)植株生命力衰退并最終自然死亡的一系列變化過(guò)程。植物衰老在細(xì)胞層面上通常分為兩種：一種是細(xì)胞分裂能力的喪失，稱(chēng)為有絲分裂性衰老；一種是成熟細(xì)胞退行性變化直到死亡的過(guò)程，稱(chēng)為有絲分裂后細(xì)胞衰老。目前有關(guān)植物衰老的研究，都集中于葉片衰老和果實(shí)成熟上。這2種都是屬于有絲分裂后細(xì)胞衰老[1]。

植物葉片衰老基本上是由葉齡來(lái)控制的，同時(shí)也受葉片內(nèi)部以及環(huán)境信號(hào)等綜合影響，也就是說(shuō)，葉片衰老是響應(yīng)了葉肉細(xì)胞的年齡信息以及內(nèi)外環(huán)境信號(hào)之后的綜合應(yīng)答。誘發(fā)植物衰老的因素有很多，暗處理是最簡(jiǎn)單也是最有效的誘導(dǎo)衰老方法，它可以使葉片衰老趨向于同步化，且局部暗處理衰老也是局部的，可以推斷暗處理誘導(dǎo)衰老是細(xì)胞自發(fā)性的[2]，目前認(rèn)為可能與黑暗處理中的糖饑餓有關(guān)，且蛋白磷酸激酶和鈣信號(hào)通路可能參與了這一過(guò)程[3]。眾多植物激素也或多或少地參與了植物衰老過(guò)程[4]。蔗糖信號(hào)也參與了植物的衰老調(diào)控，有研究表明過(guò)高的糖含量可以有效地抑制光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，過(guò)表達(dá)的己糖激酶可以使內(nèi)源蔗糖含量增高，從而導(dǎo)致光合能力下降，使葉片提前衰老[5]。氧化脅迫是溫度、水分、鹽堿、重金屬、紫外等多種環(huán)境因子誘導(dǎo)植物衰老的共同機(jī)制[6-7]，但具體的作用方式還不清楚。

在植物中，葉綠素分解和光合能力不斷下降常伴隨衰老發(fā)生。衰老是一種內(nèi)在程序化的退化過(guò)程，最終導(dǎo)致植物成熟、死亡，早衰則導(dǎo)致作物品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低[8-10]。相對(duì)于葉綠素合成途徑，對(duì)葉綠素分解代謝途徑的研究還不是很深入。Jiang等[11]通過(guò)γ射線(xiàn)誘變，在水稻中篩選出一株滯綠突變體，在衰老過(guò)程中該突變體的突變基因是水稻SGR（stay green rice）的一個(gè)等位基因，他認(rèn)為SGR可能參與PaO活性的調(diào)控，從而影響葉綠素和色素蛋白復(fù)合體的降解。Sato等[12]研究表明，SGR 在葉片衰老期間可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控葉綠素降解酶而參與葉綠素的降解途徑。最近，在水稻中克隆1個(gè)具有葉綠素 b還原酶活性的NYC1（Nonyellow coloring 1）基因，推測(cè)NYC1具有葉綠素b還原酶活性[13]。蒯本科實(shí)驗(yàn)室篩選得到了AtNYE1缺失突變體nye1-1，在黑暗誘導(dǎo)的衰老過(guò)程中葉綠素降解明顯延緩。AtNYE1基因的克隆為葉綠素降解代謝的分子調(diào)控機(jī)制研究提供了一個(gè)有效切入點(diǎn)[13]。該實(shí)驗(yàn)室還通過(guò)對(duì)滯綠突變體nye1-1的篩選、鑒定和遺傳分析得出AtNYE1是葉綠素降解的正調(diào)控因子，而過(guò)量表達(dá)AtNYE1會(huì)引起葉片黃化。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)擬南芥中的SGR2（At4g11910）基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它可能是AtNYE1（At4g22920）的一個(gè)同源基因，和AtNYE1的相似性達(dá)75%，可能屬于SGR類(lèi)葉綠素降解相關(guān)基因。筆者從美國(guó)索爾克研究所（Salk Institute）擬南芥種子資源庫(kù)購(gòu)買(mǎi)了SGR2（At4g11910）基因的T-DNA插入突變體，通過(guò)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)該基因的T-DNA插入突變體的葉綠素?zé)晒馀c野生型有明顯變化。結(jié)合前期研究[14-15]，又對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)它可能參與了植物衰老與葉綠素降解過(guò)程。

1材料與方法

1.1材料

選取野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，colo-0） 和T-DNA插入突變體作為試驗(yàn)材料。

種子用0.1%升汞浸泡5 min消毒，再用無(wú)菌雙蒸水沖洗5遍后，播種于0.443% MS（murashige and skoog） 固體培養(yǎng)基上，置于4 ℃純化36～48 h，置于光周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室條件下培養(yǎng)14 d，然后將無(wú)菌培養(yǎng)的擬南芥幼苗移栽到裝有腐殖土和蛭石（體積比為1∶1） 的小花盆中進(jìn)行盆栽培養(yǎng)，每盆植入大小一致的小苗6株， 培養(yǎng)28 d后，測(cè)定鮮質(zhì)量、生長(zhǎng)相關(guān)生理指標(biāo)和衰老相關(guān)指標(biāo)，并進(jìn)行RT-PCR分析[15]。

1.2方法

1.2.1T-DNA插入突變體鑒定。T-DNA插入突變體購(gòu)自美國(guó)索爾克研究所（Salk Institure）擬南芥種子資源庫(kù) ，取20 d左右的葉片，提取DNA鑒定純合體，原理如圖1，引物見(jiàn)表1。

1.2.2葉綠素?zé)晒夥治觥?/p>

將材料進(jìn)行20 min以上的暗適應(yīng)，置于葉綠熒光快速成像系統(tǒng)下進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。通過(guò)測(cè)量Fv/Fm（PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率）數(shù)值確定光系統(tǒng)PSⅡ的光化學(xué)參數(shù)。

1.2.3葉綠素含量測(cè)定。

取生長(zhǎng)30 d長(zhǎng)勢(shì)良好的擬南芥葉片（0.03 g），分別添加到含3 mL 95%乙醇的試管中，試管用錫紙避光處理，防止葉綠素降解。水浴鍋中放入上述樣品保持3 h，溫度設(shè)置為43 ℃，最后用紫外分光光度計(jì)依次測(cè)663、645 nm處的吸光度，按照公式Ca=12.70A663-2.59A645，Cb=22.90A645-4.67A663，計(jì)算葉綠素a、b含量。

1.2.4可溶性總糖含量測(cè)定。

擬南芥葉片經(jīng)液氮充分研磨后用TrisHCl 緩沖液（1 mol/L，pH 7.15） 抽提可溶性總糖， 根據(jù)Yemm等[16]方法測(cè)定可溶性總糖含量。

1.2.5可溶性蛋白含量測(cè)定。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的擬南芥葉片0.2 g，用考馬斯亮藍(lán)G250（coomassie brilliant blue，G250）方法[17]測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.2.6生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程觀(guān)察。對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，重點(diǎn)考察野生型和突變體之間抽薹開(kāi)花時(shí)間的差異。

1.2.7熒光定量PCR分析。

在液氮中將植物材料研磨成粉狀， 總RNA用Trizol 試劑（ Invitrogen，USA） 提取， 操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將抽提到的RNA溶解于RNasefree水，然后用DNaseI（Promaga，USA） 處理徹底去除基因組DNA， 用苯酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)， 最后用乙醇沉淀后重新溶于RNasefree水， 用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，每個(gè)樣品取等量總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，USA） 進(jìn)行第1鏈cDNA合成， 以擬南芥18S rRNA（At3g41768） 作為內(nèi)參進(jìn)行PCR分析，PCR反應(yīng)選用的基因引物序列見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1純合突變體鑒定

運(yùn)用NCBI Blast通過(guò)搜索選取與擬南芥NYE1（SGR1，At4g22920）同源性最高（達(dá)75%）的基因At4g11910進(jìn)行研究，文中稱(chēng)為SGR2。從擬南芥突變體庫(kù)中得到2個(gè)該基因的T-DNA插入突變體株系（N502718和N561388），篩選鑒定得到純合突變體株系（圖2）。進(jìn)行基因表達(dá)鑒定，發(fā)現(xiàn)在突變體中該基因表達(dá)明顯下調(diào)（圖3）。

2.2葉綠素含量Cs1336為已知的晚衰突變體，在該試驗(yàn)中作為晚衰的對(duì)照。由圖4可知，與野生型相比，突變體N561388和N502718中葉綠素a含量分別提高了37.91%和34.48%，葉綠素b含量分別提高了32.10%和33.70%。

2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)

N561388和N502718均為SGR2基因的T-DNA插入突變體，在表型上均表現(xiàn)為滯綠。對(duì)2種突變體及對(duì)照組野生型植株進(jìn)行暗適應(yīng)20 min后，測(cè)定其PSⅡ 的光化學(xué)效率，結(jié)果表明突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）比野生型低0.15左右（圖5）。

2.7基因表達(dá)情況

RBCS 和CAB是光合作用相關(guān)基因，也是衰老的重要指標(biāo)。用RT-PCR試驗(yàn)檢測(cè)RBCS 和CAB基因的表達(dá)情況。將N561388和N502718黑暗誘導(dǎo)后，提取其RNA和正常WT植株的RNA進(jìn)行定量分析，在N561388和N502718中，RBCS和CAB在葉片中的表達(dá)量都有明顯下調(diào)（圖9），這與其晚衰的表型一致。衰老相關(guān)基因SEN1在暗處理突變體中的表達(dá)量有明顯上調(diào)（圖9），說(shuō)明突變體的衰老過(guò)程，該基因同樣受到SGR2基因缺失的影響。

3結(jié)論與討論

植物衰老是一個(gè)多種因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其中葉綠素降解是重要變化之一。近來(lái)研究表明，SGR（stay green rice）及其類(lèi)似基因在水稻和擬南芥中均不止1個(gè)成員，它們參與了葉綠素降解過(guò)程，并且發(fā)揮重要作用[10，17]。SGR/SGRL可能通過(guò)與CCEs （Chl catabolic enzymes）和LHCⅡ（lightharvesting complex Ⅱ）互作而發(fā)揮作用[18-20]。

筆者選取擬南芥SGR2基因的2個(gè)T-DNA插入突變體N561388和N502718進(jìn)行研究，并與以前報(bào)道的nye11和sgr21（Salk_003830C）有關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行比較。首先N561388和N502718植株的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型植株，與 nye11的情況有所不同；不過(guò)從開(kāi)花時(shí)間上，N561388和N502718同樣表現(xiàn)出花期延遲，與nye11（SGR1缺失突變體）的表型是一致的[17]。生理檢測(cè)表明，其葉片中葉綠素a含量較野生型植株高，與nye11的表現(xiàn)類(lèi)似[17，21]，但是與Sakuraba等[22]的結(jié)果不完全符合；葉綠素a/b比野生型植株大。這一系列差異很可能改善了其光合能力，從而促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)是植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒庾兓亩攘繕?biāo)準(zhǔn)，可以直觀(guān)反映植物體光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、耗散、轉(zhuǎn)化等。通過(guò)葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定可以計(jì)算測(cè)定出光合過(guò)程對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化的響應(yīng)。葉綠素?zé)晒庥幸幌盗袇?shù)，其中比較重要的是Fv/Fm 。Fv/Fm是 PSⅡ 反應(yīng)中心暗適應(yīng)下的最大光化學(xué)效率，反映光合系統(tǒng)潛在的光化學(xué)效率，通常其數(shù)值為0.80～0.85，且基本不受物種影響。在植物受到光抑制、環(huán)境脅迫或發(fā)生某些基因突變時(shí)，F(xiàn)v/Fm會(huì)出現(xiàn)顯著變化[14，23]。筆者觀(guān)察比較了野生型和突變體中主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的變化，相較于他人研究[24]，筆者認(rèn)為葉綠素?zé)晒鈪?shù)與植物衰老及逆境有很大相關(guān)性。

可溶性蛋白含量是衡量葉片衰老特性的重要生理指標(biāo)之一，植物葉片的衰老程度往往與其可溶性蛋白含量呈負(fù)相關(guān)[25]。突變體擬南芥葉片中可溶性總蛋白含量，相比同時(shí)期野生型植株蛋白含量高，這可能延緩了葉片衰老，延長(zhǎng)了光合作用總時(shí)間，與植株抗衰老表型相輔相成；可溶性糖的分析也有類(lèi)似的結(jié)果。

衰老也會(huì)引起各種有關(guān)基因的表達(dá)變化[20]，特別是一些光合生理有關(guān)基因和衰老Marker基因均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)譜變化。RBCS和CAB基因是重要的光合相關(guān)基因，它們的表達(dá)量一般可以廣泛用作植物光合能力的判斷標(biāo)準(zhǔn)，而SEN1則是典型的衰老相關(guān)表達(dá)基因[20]。該試驗(yàn)主要分析了RBCS和CAB基因以及SEN1基因的表達(dá)量變化情況。試驗(yàn)表明，在暗處理誘導(dǎo)衰老之后，相比野生型植株，前2種基因在N561388和N502718葉片中的表達(dá)量均下調(diào)，而衰老相關(guān)基因SEN1則有明顯上調(diào)，說(shuō)明不同基因在衰老過(guò)程都會(huì)受到SGR2基因缺失的不同影響。不過(guò)，在超表達(dá)植株中，幾種基因的表達(dá)仍待檢測(cè)和分析。

衰老不是一個(gè)簡(jiǎn)單的被動(dòng)物質(zhì)降解過(guò)程。植物體內(nèi)究竟是如何來(lái)控制相關(guān)基因表達(dá)，以完成生長(zhǎng)周期最后一個(gè)階段，并使得各種成分協(xié)同作用，組成物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化的繁復(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，依然值得進(jìn)一步深入研究。而這些研究已經(jīng)并必將繼續(xù)對(duì)培育高產(chǎn)高效農(nóng)作物以及推進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，保障糧食安全起到不可替代的作用。

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