張華　李興志　張雅婷

摘要[目的]構(gòu)建EV71病毒3C蛋白的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其在細(xì)胞中的正確表達(dá)。[方法]采用RT-PCR技術(shù)，從EV71病毒基因組RNA中擴(kuò)增3C基因，克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Flag上，并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過Western blot和免疫熒光驗(yàn)證3C蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]酶切及測(cè)序鑒定顯示，EV71病毒3C真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。Western blot和免疫熒光結(jié)果證實(shí)3C蛋白在HeLa細(xì)胞中成功表達(dá)。[結(jié)論]該研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Flag-3C，為進(jìn)一步研究EV71病毒3C蛋白生物學(xué)功能奠定了一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞EV71病毒；3C蛋白；基因克?。惠d體構(gòu)建；蛋白表達(dá)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0097-03

Construction of pcDNA3.0-Flag-3C Plasmid and Its Expression of EV71 3C Protein in HeLa Cells

ZHANG Hua1，2，LI Xingzhi1，2，ZHANG Yating1，2 et al（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319；2.Biotechnology Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319）

Abstract[Objective] To construct the eukaryotic expression vector of EV71 3C protein and investigate its expression in HeLa cells.[Method] Fragment of 3C was amplified from total RNA of EV71 genome and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag.After the recombination vector was transfected into HeLa cells，Western blot and indirect immunofluorescent assay were performed to confirm the 3C protein expression.[Result] Enzyme digestion and sequencing analysis showed that eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C was constructed correctly.The results of Western blot and indirect immunofluorescent indicated 3C protein was expressed in HeLa cells.[Conclusion] This research successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C， which might provide the foundation of research about the biological function of EV71 3C protein.

Key wordsEV71 virus； 3C protein； Gene clone； Vector construction；Protein expression

基金項(xiàng)目黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目（12541578）。

作者簡(jiǎn)介張華（1979—），男，湖北荊州人，副教授，博士，從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，從事分子病毒免疫與基因工程制藥研究。

收稿日期2017-12-07

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）是屬于小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，F(xiàn)MDV病毒感染會(huì)引起偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、接觸性傳染病。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV病毒的致病性與其自身編碼的3C蛋白密切相關(guān)，其具有幫助病毒自身復(fù)制、切割宿主蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、逃避宿主免疫監(jiān)視的重要生物學(xué)功能[1]。

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)同屬小RNA病毒科的腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）同樣具有切割宿主因子[2]，拮抗宿主天然免疫等現(xiàn)象[3]。有報(bào)道指出，EV71病毒的3C蛋白在病毒生命周期中發(fā)揮舉足輕重的作用[4]，而抑制3C蛋白功能可以有效抑制病毒的復(fù)制[5]，這些研究提示人們EV71病毒3C蛋白具有發(fā)揮類似FMDV病毒3C蛋白功能的可能性，但是諸多小RNA病毒科病毒在感染過程中，3C蛋白是否發(fā)揮相同的生物學(xué)功能尚不清楚。為了進(jìn)一步研究小RNA病毒科3C蛋白的功能是否具有普遍相似性，并嘗試解析3C蛋白的結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)，筆者構(gòu)建了EV71病毒3C蛋白真核表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證，以期為深入研究FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白功能的異同奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

HeLa細(xì)胞由分子病毒免疫與基因工程制藥實(shí)驗(yàn)室凍存復(fù)蘇；鼠單克隆抗Flag抗體和TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Invitrogen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于Omega公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；引物合成和序列測(cè)定由Invitrogen完成；限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind Ⅲ、逆轉(zhuǎn)錄MLV酶和Ex Taq聚合酶購自TaKaRa公司；pcDNA3.0-Flag真核表達(dá)載體由分子病毒免疫與基因工程制藥實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建路線

根據(jù)NCBI GenBank網(wǎng)站所提供的基因序列（Accession No.：NM_006559），設(shè)計(jì)擴(kuò)增EV71病毒3C基因的引物，引物序列為

上游引物：5′-AAGCTTGGGCCCAGCTTAGACTTCGCCTTGT-3′（Hind Ⅲ）；下游引物：5′-GAATTCCTTGCTCGCTGGCAAAATAACTCCTC-3′（BamH I）。

將EV71病毒3C插入pcDNA3.0-Flag質(zhì)粒的Hind Ⅲ/BamH I位點(diǎn)，構(gòu)建載體的路線如圖1所示。

1.3EV71病毒3C基因的擴(kuò)增

首先采用Trizol試劑提取EV71病毒基因組RNA，使用MLV酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用PCR技術(shù)擴(kuò)增EV71病毒3C目的基因，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)反應(yīng)循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min，切下目的條帶，膠回收，PCR產(chǎn)物測(cè)序。反應(yīng)體系為10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板50～500 ng，Ex Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至50 μL，瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶進(jìn)行膠回收。

1.4pcDNA3.0-Flag-3C表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I雙酶切pcDNA3.0-Flag載體和EV71病毒3C片段。所用酶切體系分別為pcDNA3.0-Flag載體1 μg，Hind Ⅲ 1 μL，BamH I 1 μL，10×M Buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL；PCR產(chǎn)物EV71病毒3C 1 μg，Hind Ⅲ 1 μL，BamH I 1 μL，10×M Buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL，瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物16 ℃進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，并涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定及序列測(cè)定，鑒定正確的質(zhì)粒，命名為pcDNA3.0-Flag-3C。

1.5脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d將HeLa細(xì)胞接種至24孔板中，1×105細(xì)胞/孔，使細(xì)胞達(dá)90%～95%匯合度。用50 μL Opti-MEM稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混合，取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合，室溫孵育5 min；將50 μL LipofectamineTM2000混合物加入質(zhì)粒DNA中，總體積為100 μL，輕輕混合，室溫孵育20 min；將100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中，輕輕混勻，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液，37 ℃孵育，觀察24～48 h的轉(zhuǎn)染情況。

1.6Western blot驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24～48 h，提取重組質(zhì)粒pcDNA3.0-Flag-3C轉(zhuǎn)染組的總蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS洗2次后加入RIPA裂解液，冰浴5 min，將裂解物12 000 r/min離心10 min后收集上清。在12% SDS-PAGE上分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h后，用小鼠抗Flag克隆抗體室溫孵育1 h，再經(jīng)洗膜，并與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，最后經(jīng)發(fā)光反應(yīng)，并曝光于X光片上，拍照。

1.7間接免疫熒光

細(xì)胞爬片，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，24～48 h用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Trixton-100透膜處理20 min，鼠單克隆抗Flag抗體室溫孵育1 h，PBS洗滌后，TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗孵育1 h，PBS清洗后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

2結(jié)果與分析

2.1EV71病毒3C的PCR擴(kuò)增

逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA成為cDNA，并以總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增EV71病毒3C基因片段，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物約為549 bp，與預(yù)計(jì)大小相同，為所需要的EV71病毒3C片段（圖2）。

2.4 Western blot檢測(cè)在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的重組融合蛋白

利用鼠抗Flag單克隆抗體檢測(cè)pcDNA3.0-Flag-3C重組載體的表達(dá)，結(jié)果顯示在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的重組載體能特異性結(jié)合Flag單克隆抗體，蛋白大小與預(yù)期相符（圖5）。

3結(jié)論與討論

小RNA病毒科病毒主要包括口蹄疫病毒、鼻病毒、腦心肌炎病毒、腸道病毒，它不僅是感染家畜的重要病原體，而且也是感染人的重要病原體。包括EV71病毒在內(nèi)的諸多小RNA病毒感染機(jī)體后，嚴(yán)重者可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥，甚至死亡[6]，小RNA病毒科病毒感染會(huì)給國民生命財(cái)產(chǎn)安全和畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大的損失，這是不容忽視的。

小RNA病毒科的多種病毒都編碼3C蛋白酶，作為小RNA病毒科眾多種屬中的共同水解蛋白酶，其不僅在剪切病毒蛋白前體、促進(jìn)病毒復(fù)制中起重要作用，而且可以通過抑制抗病毒天然免疫應(yīng)答，使病毒自身在宿主細(xì)胞中大量增殖[7]。脊髓灰質(zhì)炎病毒和EV71病毒的3C蛋白可以直接裂

解RIG-I，從而抑制RIG-I下游信號(hào)[8]。甲型肝炎病毒[9]、

鼻病毒[10]和柯薩奇病毒B組3型[11]的3C蛋白可以通過直接裂解MAVS來抑制I型感染素的產(chǎn)生。FMDV病毒的3C蛋白不僅能夠切割宿主蛋白PCBP2，影響宿主蛋白的翻譯，而且能夠通過阻礙IRF-3/7的活化抑制IFN-α1/β啟動(dòng)子的激活，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[12]。這些研究預(yù)示著，3C蛋白酶的研究將會(huì)在重大病毒性疾病，如手足口病、口蹄疫、病毒性心肌炎、甲型肝炎、病毒性感冒、病毒性咽峽炎等的攻克方面發(fā)揮重要的指導(dǎo)價(jià)值。

通過前期對(duì)FMDV病毒3C蛋白的研究，提示EV71病毒3C蛋白也可能具有相似的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步比較FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白生物學(xué)功能的差異，構(gòu)建了3C蛋白的真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HeLa真核細(xì)胞，驗(yàn)證其表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后的結(jié)果顯示EV71病毒3C蛋白在細(xì)胞內(nèi)能夠正確表達(dá)，證明構(gòu)建和轉(zhuǎn)染都是成功的。在高效表達(dá)EV71病毒3C蛋白后，采用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光在HeLa細(xì)胞中的分布，結(jié)果顯示EV71病毒3C蛋白均勻定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。該研究為后續(xù)深入研究小RNA病毒3C蛋白的生物學(xué)功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

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