周建設(shè)　潘虎　陳美群

摘要[目的]了解病死黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落的變化及其與黑斑原鮡死亡的關(guān)系。[方法]利用新一代高通量測序技術(shù)，研究病死黑斑原鮡表皮皮膚黏液和腸道內(nèi)容物微生物群落的變化及其對黑斑原鮡死亡的影響。[結(jié)果]黑斑原鮡病變死亡后，腸道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3種優(yōu)勢微生物菌群增加；黑斑原鮡病變死亡后其表皮皮膚黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4種優(yōu)勢微生物菌群增加。[結(jié)論]細菌和真菌在黑斑原鮡表皮和腸道中菌群的變化，可能是導(dǎo)致黑斑原鮡病變死亡的主要原因之一。

關(guān)鍵詞黑斑原鮡；表皮；腸道；微生物群落

中圖分類號S917.1文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2018）08-0080-06

Study on the Microbial Community in the Epidermis and Intestinal Tract of Dead Glyptosternum maculatum

ZHOU Jianshe1， PAN Hu2， CHEN Meiqun1 et al （1.Institute of Fisheries Science， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032；2.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032）

Abstract[Objective] To investigate the changes of microbial community in the epidermis and intestinal tract of dead Glyptosternum maculatum and their relationship with the death of G. maculatum. [Method] The changes of microbial community in the epidermal mucus and intestinal contents of dead G. maculatum and their effects on the death of G. maculatum were studied by using new generation of high throughput sequencing technique. [Result] After G. maculatum died， six major microbial flora of Acinetobacter sp.，F(xiàn)lavobacterium sp.， Vagococcus sp.， Carnobacterium sp.， Bacillus sp. and Malassezia sp. in the intestinal tract of dead G. maculatum reduced， but three dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Tremellales and Agaricomycetes） increased. In the epidermal mucus of dead G. maculatum， 8 dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Vagococcus sp.， Providencia sp. ， Morganella sp.， Pleosporales， Mucorales， Tremellales， Agaricomycetes） decreased， but four dominant microbial flora （Acetobacter sp.， Proteus sp.， Carnobacterium sp. and Malassezia sp.） increased. [Conclusion] The microbial flora of bacteria and fungi in the epidermis and intestinal tract of G. maculatum might be one of main causes that led the lesions and death of G. maculatum.

Key wordsGlyptosternum maculatum；Epidermis；Intestinal tract；Microbial community

基金項目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項（201403012）；西藏自治區(qū)財政專項（藏財農(nóng)指69號）。

作者簡介周建設(shè)（1985—），男，甘肅會寧人，助理研究員，碩士，從事魚類遺傳育種與繁殖研究。*通訊作者，研究員，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)、現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。

收稿日期2017-10-27；修回日期2018-01-02

黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum），隸屬鲇形目鮡科原鮡屬，主要分布于我國西藏的雅魯藏布江流域及印度的Indus River[1]。黑斑原鮡分布區(qū)水溫常年低于15 ℃，水流較為湍急[1-2]，野性很強，人工馴化養(yǎng)殖困難，在人工馴養(yǎng)過程中往往因為皮膚潰爛等原因發(fā)生死亡。研究發(fā)現(xiàn)，魚類腸道菌群的失衡可能引起多種疾病的產(chǎn)生，而一旦生病也會導(dǎo)致魚類菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3-4]，潰瘍病、爛鰭病等[5]皮膚疾病也能造成魚類病變死亡。近年來，基于宏基因組的高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展[6]，已被廣泛應(yīng)用于微生物群落組成多樣性等研究領(lǐng)域。筆者采用Illumina高通量測序技術(shù)對黑斑原鮡健康個體和病變死亡個體的表皮皮膚黏液及腸道內(nèi)容物的微生物多樣性組成進行了分析，從宏基因組水平上探討了黑斑原鮡病變死亡前后表皮和腸道微生物群落的變化。

1材料與方法

1.1試驗材料

2015年4月在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地收集健康黑斑原鮡和病變死亡的黑斑原鮡各5條，體質(zhì)量（161.7± 2.0）g，體長（26.0± 0.8）cm，在無菌條件下分別用50 mL滅菌離心管收集健康和病變死亡的黑斑原鮡的皮膚黏液及腸道內(nèi)容物樣品，分別編號為1號（病變死亡黑斑原鮡皮膚黏液樣品）、2號（病變死亡黑斑原鮡腸道內(nèi)容物樣品）、3號（健康黑斑原鮡皮膚黏液樣品）、4號（健康黑斑原鮡腸道內(nèi)容物樣品），所有樣品于-20 ℃下保藏備用。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取。

黑斑原鮡皮膚黏液和腸道內(nèi)容物樣品微生物總DNA使用TIANGEN公司土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）提取。所提取的DNA于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細菌16S rDNA-V3區(qū)的PCR擴增及測序。

采用細菌V3區(qū)通用引物 338F/518R見表1。PCR擴增體系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，無菌水37.75 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.2.3真菌18S rDNA部分片段的PCR擴增及測序。

采用巢式PCR擴增法擴增真菌18S rDNA區(qū)目的片段。巢式PCR第一輪擴增采用GeoA2/Geo11引物見表1，PCR擴增體系（50 μL）

如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，無菌水37.75 μL。巢式PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物用 min Elute PCR Purefication Kit 純化。巢式PCR第二輪擴增采用F-Primer/R-Primer引物見表1，PCR擴增體系（50 μL）為：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板38.75 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，47 ℃30 s，72 ℃ 1 min，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.2.4生物信息學(xué)分析。

測序結(jié)果使用CASAVA 1.8.2 軟件進行圖像堿基識別，初步質(zhì)量分析后得到測序數(shù)據(jù)（Pass Filter Data，PF data），應(yīng)用軟件Pandaseq（v2.7）和Trimmomatic（v0.33）軟件進行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析，以獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)。計算在 97% 的相似水平上每個樣本的操作分類單元（OTU）的數(shù)量，并構(gòu)建稀疏曲線[7]。利用Qiime 1.7 軟件，并分別計算各樣本α多樣性指數(shù)和β多樣性指數(shù)，分析方法為序列隨即抽樣的方法，用RDP classifier進行物種分類注釋，以得到每個樣本的群落組成。

2結(jié)果與分析

2.1不同樣本微生物多樣性分析

對黑斑原鮡病死表皮、病死腸道、健康表皮和健康腸道中高通量測序的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計（表2，表3），4個樣本總共獲得了115 185條合格的16S rDNA序列，有效序列的平均長度為189 bp，健康表皮和腸道的有效OUT數(shù)量明顯少于病死表皮和腸道的OUT數(shù)量，表明病死表皮和腸道中的細菌多樣性顯著低于健康表皮和腸道中的細菌多樣性。共獲得567 663條合格的18S rDNA序列，有效序列平均長度為354 bp，和細菌的多樣性統(tǒng)計不同，健康表皮的真菌多樣性高于病死表皮，而健康腸道的真菌多樣性低于病死表皮?；贠bserved OTUs數(shù)，構(gòu)建的稀釋曲線（rarefaction curve）（圖1）。從各樣品的rarefaction曲線可以看出，各樣品的曲線均趨向平坦，說明測序的數(shù)據(jù)量合理。

通過Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods-coverage指數(shù)對樣品的豐度及多樣性進行比較分析（表4），Chao指數(shù)可反映各樣本的菌群豐度，病死黑斑原鮡表皮和腸道中細菌豐度與健康表皮和腸道相比明顯增加，分別增加了48.6%和44.6%；Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods-coverage指數(shù)可反映出各樣本的菌群多樣性，病死黑斑原鮡表皮和腸道中細菌多樣性與健康表皮和腸道相比有所減少，分別減少了15.4%和38.7%；病死黑斑原鮡表皮真菌多樣性與健康表皮相比有所減少，而腸道中真菌的多樣性有所增加。

2.2不同樣本微生物豐度分析

為進一步明確病死與健康黑斑原鮡表皮和腸道中細菌與真菌的群落組成，使用RDP classifier對代表性序列進行物種分類注釋。從圖2可以看出，各樣本16S rDNA在門水平下得到 41個細菌門，而18S rDNA 在門水平下只有4個真菌門。基于門水平下物種注釋信息，選取豐度排名前20位的屬，繪制物種豐度聚類圖（圖3）。從圖3可以看出，細菌在屬水平下明顯被分為2類，真菌在屬水平下分為5類。各樣品中，Acinetobacter、Pseudomonas和Chryseobacterium在黑斑原鮡健康腸道中為優(yōu)勢種，其他菌屬在各樣品中豐度較低；真菌Malassezia 病死黑斑原鮡和健康黑斑原鮡皮膚與腸道中均有較高豐度， Tremellales 只在健康表皮中有較高豐度，Arachnida只在病死表皮中有較高豐度。

2.3不同樣本微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

對病死黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與健康黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進行對比分析（圖4、圖5），不動桿菌屬（Acinetobacter）在健康表皮和健康腸道中為優(yōu)勢類群，占所有微生物相對比例為41.10%和43.86%；假單胞菌屬細菌（Pseudomonas）在病死黑斑原鮡腸道中為優(yōu)勢類群，占所有微生物相對比例為26.44%；變形菌屬（Dysgonomonas）在病死黑斑原鮡表皮中為優(yōu)勢類群，占所有微生物相對比例為43.34%。擔(dān)子菌類真菌（Tremellales）在健康黑斑原鮡表皮中為優(yōu)勢類群，占所有微生物相對比例為52.9%；馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）在病死黑斑原鮡表皮、腸道和健康黑斑原鮡腸道中為優(yōu)勢類群，占所有微生物相對比例分別為52.24%、94.22%和73.49%。

病死黑斑原鮡表皮和腸道中的微生物相比較健康黑斑原鮡表皮和腸道微生物發(fā)生明顯改變（表5、表6），豐度排在

前20位的細菌屬中14個屬的豐度在病死黑斑原鮡表皮中有所增加，增加倍數(shù)最多的是變形菌屬（Dysgonomonas），而厚壁菌門屬（Rummeliibacillus）在病死黑斑原鮡表皮中未檢測到； 17個屬的豐度在病死黑斑原鮡腸道中有所增加，增加倍數(shù)最多的是毗鄰單胞菌屬（Plesiomonas），為270倍。豐度

3討論與結(jié)論

3.1病死黑斑原鮡表皮微生物的變化

與其他動物不同，魚類皮膚沒有角質(zhì)化，因此皮膚長期與水接觸會導(dǎo)致魚類的體表成為病原微生物最容易入侵的途徑[8]。大量研究表明，魚類表皮微生物是其重要的組成部分，表皮微生物可能直接影響到魚類的正常生長發(fā)育、生理平衡等[9-10]。

該研究發(fā)現(xiàn)，黑斑原鮡因水霉菌病變死亡后其表皮皮膚及腸道細菌群落和真菌多樣性的改變。張正等[11]研究了半滑舌鰨腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)生疾病后的魚腸道細菌多樣性較健康個體明顯減少，與該研究結(jié)果相一致。黑斑原鮡病變死亡后其表皮皮膚黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8種優(yōu)勢微生物菌群在減少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4種優(yōu)勢微生物菌群在增加，其中Providencia sp.（19.41%）、Pleosporales（5.157%）、Mucorales（4.223%）菌群的減少和Proteus sp.（25.26%）、 Pseudomonas sp.（10.821%）菌群的增加尤為顯著。

假單胞桿菌屬細菌（Pseudomonas sp.）是低溫腐敗菌[12]。綦國紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌是一種導(dǎo)致魚類等蛋白質(zhì)含量豐富的食品腐敗的重要腐敗細菌，其通過產(chǎn)生N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號分子，以密度依賴的方式調(diào)控某些生理特性的表達，造成腐敗。鄒金虎[14]研究表明，假單胞桿菌能引起魚類皮膚潰爛的細菌之一。漫游菌屬是1989年Collin發(fā)現(xiàn)的新菌屬[15]，模式種是河流漫游菌（Vagcoccus fluvialis），是從水或鮭魚中分離到，而1990年、1999年、2000年報道了鮭漫游菌（Vagcoccus salmeninarum），Vagcoccus lutrae和Vagcoccus fessus，目前共有4個種，其中河流漫游菌有多種來源，包括人類臨床標(biāo)本（如血液、傷口等）和動物（如雞、豬、牛等）中都可能存在該菌，鮭漫游菌是從死魚中被發(fā)現(xiàn)的，lutra漫游菌是唯一來源于水獺的細菌，fessus漫游菌是從海豹和海豚中分離得到的，目前對漫游菌的致病性未知[16-19]。黃桿菌屬（Flavobacterium）和肉桿菌屬（Carnobacterium）是造成冷藏魚類腐敗變質(zhì)的重要微生物類群[20]。馬拉色霉菌屬真菌（Malassezia sp.）[20]是一類嗜脂性條件致病菌，是造成動物多種皮膚疾病的常見菌群。因此，死亡的黑斑原鮡表皮的微生物群落中與腐敗變質(zhì)相關(guān)的微生物豐度增加。

3.2病死黑斑原鮡腸道微生物的變化

魚的腸道內(nèi)存在大量的微生物，與魚類共存，在長期進化過程中與魚類腸道形成了一個穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，許多長期定居在魚類腸道中微生物對魚類具有營養(yǎng)、防御和免疫調(diào)節(jié)等生理功能，并且對其生長發(fā)育也具有重要作用[21]，魚苗的腸道微生物群落在孵化后能夠在數(shù)小時內(nèi)完成定植，，定植菌可以調(diào)節(jié)消化道中的基因表達，創(chuàng)造出適宜的棲息環(huán)境，并防止其他細菌侵入[4]。

該研究發(fā)現(xiàn)，黑斑原鮡病變死亡后其腸道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6種優(yōu)勢微生物菌群減少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3種優(yōu)勢微生物菌群增加，其中Malassezia sp.（13.614%）菌群的減少和Pseudomonas sp.（39.06%）、Tremellales（8.748%）、Agaricomycetes（1.818%）菌群的增加較為明顯。吳金鳳等[22]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）健康狀態(tài)有指示作用，在發(fā)病對蝦腸道中，F(xiàn)lavobacterium和Bacillus等有益菌的豐度顯著降低，蝦腸道細菌群落多樣性顯著低于健康對蝦，而該研究中黑斑原鮡腸道中Flavobacterium和Bacillus豐度的高低，也可能作為其是否健康的標(biāo)準(zhǔn)。該研究還發(fā)現(xiàn)Pseudomonas sp. 的豐度與在腸道中的變化趨勢與表皮中的趨勢一致，Pseudomonas sp.是一種致病菌，可能引起感染疾病，引起死亡。這表明黑斑原鮡病變死亡是由細菌、真菌和病原動物共同作用的結(jié)果。

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