周建設(shè)　潘虎　陳美群

摘要[目的]了解病死黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落的變化及其與黑斑原鮡死亡的關(guān)系。[方法]利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，研究病死黑斑原鮡表皮皮膚黏液和腸道內(nèi)容物微生物群落的變化及其對(duì)黑斑原鮡死亡的影響。[結(jié)果]黑斑原鮡病變死亡后，腸道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6種優(yōu)勢(shì)微生物菌群減少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3種優(yōu)勢(shì)微生物菌群增加；黑斑原鮡病變死亡后其表皮皮膚黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8種優(yōu)勢(shì)微生物菌群減少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4種優(yōu)勢(shì)微生物菌群增加。[結(jié)論]細(xì)菌和真菌在黑斑原鮡表皮和腸道中菌群的變化，可能是導(dǎo)致黑斑原鮡病變死亡的主要原因之一。

關(guān)鍵詞黑斑原鮡；表皮；腸道；微生物群落

中圖分類號(hào)S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0080-06

Study on the Microbial Community in the Epidermis and Intestinal Tract of Dead Glyptosternum maculatum

ZHOU Jianshe1， PAN Hu2， CHEN Meiqun1 et al （1.Institute of Fisheries Science， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032；2.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032）

Abstract[Objective] To investigate the changes of microbial community in the epidermis and intestinal tract of dead Glyptosternum maculatum and their relationship with the death of G. maculatum. [Method] The changes of microbial community in the epidermal mucus and intestinal contents of dead G. maculatum and their effects on the death of G. maculatum were studied by using new generation of high throughput sequencing technique. [Result] After G. maculatum died， six major microbial flora of Acinetobacter sp.，F(xiàn)lavobacterium sp.， Vagococcus sp.， Carnobacterium sp.， Bacillus sp. and Malassezia sp. in the intestinal tract of dead G. maculatum reduced， but three dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Tremellales and Agaricomycetes） increased. In the epidermal mucus of dead G. maculatum， 8 dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Vagococcus sp.， Providencia sp. ， Morganella sp.， Pleosporales， Mucorales， Tremellales， Agaricomycetes） decreased， but four dominant microbial flora （Acetobacter sp.， Proteus sp.， Carnobacterium sp. and Malassezia sp.） increased. [Conclusion] The microbial flora of bacteria and fungi in the epidermis and intestinal tract of G. maculatum might be one of main causes that led the lesions and death of G. maculatum.

Key wordsGlyptosternum maculatum；Epidermis；Intestinal tract；Microbial community

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(xiàng)（201403012）；西藏自治區(qū)財(cái)政專項(xiàng)（藏財(cái)農(nóng)指69號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介周建設(shè)（1985—），男，甘肅會(huì)寧人，助理研究員，碩士，從事魚(yú)類遺傳育種與繁殖研究。*通訊作者，研究員，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)、現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。

收稿日期2017-10-27；修回日期2018-01-02

黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum），隸屬鲇形目鮡科原鮡屬，主要分布于我國(guó)西藏的雅魯藏布江流域及印度的Indus River[1]。黑斑原鮡分布區(qū)水溫常年低于15 ℃，水流較為湍急[1-2]，野性很強(qiáng)，人工馴化養(yǎng)殖困難，在人工馴養(yǎng)過(guò)程中往往因?yàn)槠つw潰爛等原因發(fā)生死亡。研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類腸道菌群的失衡可能引起多種疾病的產(chǎn)生，而一旦生病也會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3-4]，潰瘍病、爛鰭病等[5]皮膚疾病也能造成魚(yú)類病變死亡。近年來(lái)，基于宏基因組的高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展[6]，已被廣泛應(yīng)用于微生物群落組成多樣性等研究領(lǐng)域。筆者采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黑斑原鮡健康個(gè)體和病變死亡個(gè)體的表皮皮膚黏液及腸道內(nèi)容物的微生物多樣性組成進(jìn)行了分析，從宏基因組水平上探討了黑斑原鮡病變死亡前后表皮和腸道微生物群落的變化。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2015年4月在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地收集健康黑斑原鮡和病變死亡的黑斑原鮡各5條，體質(zhì)量（161.7± 2.0）g，體長(zhǎng)（26.0± 0.8）cm，在無(wú)菌條件下分別用50 mL滅菌離心管收集健康和病變死亡的黑斑原鮡的皮膚黏液及腸道內(nèi)容物樣品，分別編號(hào)為1號(hào)（病變死亡黑斑原鮡皮膚黏液樣品）、2號(hào)（病變死亡黑斑原鮡腸道內(nèi)容物樣品）、3號(hào)（健康黑斑原鮡皮膚黏液樣品）、4號(hào)（健康黑斑原鮡腸道內(nèi)容物樣品），所有樣品于-20 ℃下保藏備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取。

黑斑原鮡皮膚黏液和腸道內(nèi)容物樣品微生物總DNA使用TIANGEN公司土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）提取。所提取的DNA于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)的PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

采用細(xì)菌V3區(qū)通用引物 338F/518R見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，無(wú)菌水37.75 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq。

1.2.3真菌18S rDNA部分片段的PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

采用巢式PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增真菌18S rDNA區(qū)目的片段。巢式PCR第一輪擴(kuò)增采用GeoA2/Geo11引物見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）

如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，無(wú)菌水37.75 μL。巢式PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用 min Elute PCR Purefication Kit 純化。巢式PCR第二輪擴(kuò)增采用F-Primer/R-Primer引物見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板38.75 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，47 ℃30 s，72 ℃ 1 min，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min， 4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq。

1.2.4生物信息學(xué)分析。

測(cè)序結(jié)果使用CASAVA 1.8.2 軟件進(jìn)行圖像堿基識(shí)別，初步質(zhì)量分析后得到測(cè)序數(shù)據(jù)（Pass Filter Data，PF data），應(yīng)用軟件Pandaseq（v2.7）和Trimmomatic（v0.33）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析，以獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)。計(jì)算在 97% 的相似水平上每個(gè)樣本的操作分類單元（OTU）的數(shù)量，并構(gòu)建稀疏曲線[7]。利用Qiime 1.7 軟件，并分別計(jì)算各樣本α多樣性指數(shù)和β多樣性指數(shù)，分析方法為序列隨即抽樣的方法，用RDP classifier進(jìn)行物種分類注釋，以得到每個(gè)樣本的群落組成。

2結(jié)果與分析

2.1不同樣本微生物多樣性分析

對(duì)黑斑原鮡病死表皮、病死腸道、健康表皮和健康腸道中高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2，表3），4個(gè)樣本總共獲得了115 185條合格的16S rDNA序列，有效序列的平均長(zhǎng)度為189 bp，健康表皮和腸道的有效OUT數(shù)量明顯少于病死表皮和腸道的OUT數(shù)量，表明病死表皮和腸道中的細(xì)菌多樣性顯著低于健康表皮和腸道中的細(xì)菌多樣性。共獲得567 663條合格的18S rDNA序列，有效序列平均長(zhǎng)度為354 bp，和細(xì)菌的多樣性統(tǒng)計(jì)不同，健康表皮的真菌多樣性高于病死表皮，而健康腸道的真菌多樣性低于病死表皮。基于Observed OTUs數(shù)，構(gòu)建的稀釋曲線（rarefaction curve）（圖1）。從各樣品的rarefaction曲線可以看出，各樣品的曲線均趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序的數(shù)據(jù)量合理。

通過(guò)Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods-coverage指數(shù)對(duì)樣品的豐度及多樣性進(jìn)行比較分析（表4），Chao指數(shù)可反映各樣本的菌群豐度，病死黑斑原鮡表皮和腸道中細(xì)菌豐度與健康表皮和腸道相比明顯增加，分別增加了48.6%和44.6%；Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Goods-coverage指數(shù)可反映出各樣本的菌群多樣性，病死黑斑原鮡表皮和腸道中細(xì)菌多樣性與健康表皮和腸道相比有所減少，分別減少了15.4%和38.7%；病死黑斑原鮡表皮真菌多樣性與健康表皮相比有所減少，而腸道中真菌的多樣性有所增加。

2.2不同樣本微生物豐度分析

為進(jìn)一步明確病死與健康黑斑原鮡表皮和腸道中細(xì)菌與真菌的群落組成，使用RDP classifier對(duì)代表性序列進(jìn)行物種分類注釋。從圖2可以看出，各樣本16S rDNA在門水平下得到 41個(gè)細(xì)菌門，而18S rDNA 在門水平下只有4個(gè)真菌門?；陂T水平下物種注釋信息，選取豐度排名前20位的屬，繪制物種豐度聚類圖（圖3）。從圖3可以看出，細(xì)菌在屬水平下明顯被分為2類，真菌在屬水平下分為5類。各樣品中，Acinetobacter、Pseudomonas和Chryseobacterium在黑斑原鮡健康腸道中為優(yōu)勢(shì)種，其他菌屬在各樣品中豐度較低；真菌Malassezia 病死黑斑原鮡和健康黑斑原鮡皮膚與腸道中均有較高豐度， Tremellales 只在健康表皮中有較高豐度，Arachnida只在病死表皮中有較高豐度。

2.3不同樣本微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

對(duì)病死黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與健康黑斑原鮡表皮和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析（圖4、圖5），不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在健康表皮和健康腸道中為優(yōu)勢(shì)類群，占所有微生物相對(duì)比例為41.10%和43.86%；假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudomonas）在病死黑斑原鮡腸道中為優(yōu)勢(shì)類群，占所有微生物相對(duì)比例為26.44%；變形菌屬（Dysgonomonas）在病死黑斑原鮡表皮中為優(yōu)勢(shì)類群，占所有微生物相對(duì)比例為43.34%。擔(dān)子菌類真菌（Tremellales）在健康黑斑原鮡表皮中為優(yōu)勢(shì)類群，占所有微生物相對(duì)比例為52.9%；馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）在病死黑斑原鮡表皮、腸道和健康黑斑原鮡腸道中為優(yōu)勢(shì)類群，占所有微生物相對(duì)比例分別為52.24%、94.22%和73.49%。

病死黑斑原鮡表皮和腸道中的微生物相比較健康黑斑原鮡表皮和腸道微生物發(fā)生明顯改變（表5、表6），豐度排在

前20位的細(xì)菌屬中14個(gè)屬的豐度在病死黑斑原鮡表皮中有所增加，增加倍數(shù)最多的是變形菌屬（Dysgonomonas），而厚壁菌門屬（Rummeliibacillus）在病死黑斑原鮡表皮中未檢測(cè)到； 17個(gè)屬的豐度在病死黑斑原鮡腸道中有所增加，增加倍數(shù)最多的是毗鄰單胞菌屬（Plesiomonas），為270倍。豐度

3討論與結(jié)論

3.1病死黑斑原鮡表皮微生物的變化

與其他動(dòng)物不同，魚(yú)類皮膚沒(méi)有角質(zhì)化，因此皮膚長(zhǎng)期與水接觸會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類的體表成為病原微生物最容易入侵的途徑[8]。大量研究表明，魚(yú)類表皮微生物是其重要的組成部分，表皮微生物可能直接影響到魚(yú)類的正常生長(zhǎng)發(fā)育、生理平衡等[9-10]。

該研究發(fā)現(xiàn)，黑斑原鮡因水霉菌病變死亡后其表皮皮膚及腸道細(xì)菌群落和真菌多樣性的改變。張正等[11]研究了半滑舌鰨腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)生疾病后的魚(yú)腸道細(xì)菌多樣性較健康個(gè)體明顯減少，與該研究結(jié)果相一致。黑斑原鮡病變死亡后其表皮皮膚黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8種優(yōu)勢(shì)微生物菌群在減少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4種優(yōu)勢(shì)微生物菌群在增加，其中Providencia sp.（19.41%）、Pleosporales（5.157%）、Mucorales（4.223%）菌群的減少和Proteus sp.（25.26%）、 Pseudomonas sp.（10.821%）菌群的增加尤為顯著。

假單胞桿菌屬細(xì)菌（Pseudomonas sp.）是低溫腐敗菌[12]。綦國(guó)紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌是一種導(dǎo)致魚(yú)類等蛋白質(zhì)含量豐富的食品腐敗的重要腐敗細(xì)菌，其通過(guò)產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號(hào)分子，以密度依賴的方式調(diào)控某些生理特性的表達(dá)，造成腐敗。鄒金虎[14]研究表明，假單胞桿菌能引起魚(yú)類皮膚潰爛的細(xì)菌之一。漫游菌屬是1989年Collin發(fā)現(xiàn)的新菌屬[15]，模式種是河流漫游菌（Vagcoccus fluvialis），是從水或鮭魚(yú)中分離到，而1990年、1999年、2000年報(bào)道了鮭漫游菌（Vagcoccus salmeninarum），Vagcoccus lutrae和Vagcoccus fessus，目前共有4個(gè)種，其中河流漫游菌有多種來(lái)源，包括人類臨床標(biāo)本（如血液、傷口等）和動(dòng)物（如雞、豬、牛等）中都可能存在該菌，鮭漫游菌是從死魚(yú)中被發(fā)現(xiàn)的，lutra漫游菌是唯一來(lái)源于水獺的細(xì)菌，fessus漫游菌是從海豹和海豚中分離得到的，目前對(duì)漫游菌的致病性未知[16-19]。黃桿菌屬（Flavobacterium）和肉桿菌屬（Carnobacterium）是造成冷藏魚(yú)類腐敗變質(zhì)的重要微生物類群[20]。馬拉色霉菌屬真菌（Malassezia sp.）[20]是一類嗜脂性條件致病菌，是造成動(dòng)物多種皮膚疾病的常見(jiàn)菌群。因此，死亡的黑斑原鮡表皮的微生物群落中與腐敗變質(zhì)相關(guān)的微生物豐度增加。

3.2病死黑斑原鮡腸道微生物的變化

魚(yú)的腸道內(nèi)存在大量的微生物，與魚(yú)類共存，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與魚(yú)類腸道形成了一個(gè)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，許多長(zhǎng)期定居在魚(yú)類腸道中微生物對(duì)魚(yú)類具有營(yíng)養(yǎng)、防御和免疫調(diào)節(jié)等生理功能，并且對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育也具有重要作用[21]，魚(yú)苗的腸道微生物群落在孵化后能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成定植，，定植菌可以調(diào)節(jié)消化道中的基因表達(dá)，創(chuàng)造出適宜的棲息環(huán)境，并防止其他細(xì)菌侵入[4]。

該研究發(fā)現(xiàn)，黑斑原鮡病變死亡后其腸道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6種優(yōu)勢(shì)微生物菌群減少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3種優(yōu)勢(shì)微生物菌群增加，其中Malassezia sp.（13.614%）菌群的減少和Pseudomonas sp.（39.06%）、Tremellales（8.748%）、Agaricomycetes（1.818%）菌群的增加較為明顯。吳金鳳等[22]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）健康狀態(tài)有指示作用，在發(fā)病對(duì)蝦腸道中，F(xiàn)lavobacterium和Bacillus等有益菌的豐度顯著降低，蝦腸道細(xì)菌群落多樣性顯著低于健康對(duì)蝦，而該研究中黑斑原鮡腸道中Flavobacterium和Bacillus豐度的高低，也可能作為其是否健康的標(biāo)準(zhǔn)。該研究還發(fā)現(xiàn)Pseudomonas sp. 的豐度與在腸道中的變化趨勢(shì)與表皮中的趨勢(shì)一致，Pseudomonas sp.是一種致病菌，可能引起感染疾病，引起死亡。這表明黑斑原鮡病變死亡是由細(xì)菌、真菌和病原動(dòng)物共同作用的結(jié)果。

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