尹利端 石麗花 王長偉 鞠東 李八方 劉楚怡

摘要 [目的]評(píng)價(jià)不同分子量松花肽的體內(nèi)和體外抗氧化能力。[方法]通過體外抗氧化試驗(yàn)和老齡小鼠體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)不同平均分子量松花肽的抗氧化能力。體外部分，研究了9種松花肽的超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基清除能力；體內(nèi)部分，采用老齡Balb/c種小鼠，研究體外試驗(yàn)中效果最好的2種松花肽對(duì)小鼠體內(nèi)丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力和谷光甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響。[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)平均分子量為1 565和561 Da的松花肽具有更好的超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除能力，并能夠顯著增加老齡小鼠的SOD活力和GSH-Px活力，顯著降低MDA的含量。[結(jié)論]2種松花肽均具有顯著的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 松花肽；分子量；動(dòng)物試驗(yàn)；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）31-0163-04

Abstract [Objective]To evaluate the in vivo and in vitro antioxidant capacity of different molecular weight pine pollen peptides.[Method]The antioxidant capacity of different average molecular weight of pine pollen peptides were evaluated synthetically by in vitro antioxidant experiments in aged mice.In vitro experiments were conducted on the inhibition of superoxide anion free radicals，hydroxyl radical inhibition，and DPPH scavenging activity of 9 pine pollen peptides.In vivo，Balb/c mice were used to study the effects of peptides on the activities of TSOD and GSHPx，and contents of MDA in aged mice.[Result]It was found that pine pollen peptides with an average molecular weight of 1 565 and 561 Da had better scavenging abilities of superoxide anion radicals，hydroxyl radicals and DPPH radicals，and could significantly increase TSOD and GSHPx activity，and significantly reduced the content of MDA in aged mice.[Conclusion]It was demonstrated that 1 kD and 13 kD pine pollen peptides have significant antioxidant activity.

Key words Pine pollen peptide；Molecular weight；Animal experiment；Antioxidant activity

人類的機(jī)體衰老機(jī)制和疾病產(chǎn)生機(jī)理長久以來都是國內(nèi)外學(xué)者們致力解決的重大科學(xué)問題[1-2]。近年來，隨著Harman自由基理論的提出，人們對(duì)人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基的認(rèn)識(shí)逐漸深入，發(fā)現(xiàn)人的衰老和多種疾病的發(fā)生都與自由基的過量產(chǎn)生相關(guān)[3]。探索安全高效的消除自由基的方法逐漸成為了當(dāng)前學(xué)者們研究的熱點(diǎn)[4]?？寡趸瘎┦墙陙戆l(fā)展較快的一類能夠消除自由基的物質(zhì)，既包括化學(xué)合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等，也包括大豆多肽等抗氧化活性多肽[5]。與化學(xué)合成的抗氧化劑相比，抗氧化多肽具有安全、高效等特點(diǎn)，能夠更廣泛地作為基料或功能因子應(yīng)用于保健食品及化妝品等功能制品的開發(fā)。

松花粉是指經(jīng)人工采集得到的馬尾松（Pinus Massoniana）等松樹的干燥花粉[6]。松花粉作為生命的遺傳物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、黃酮及必需脂肪酸等營養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)，具有延緩衰老、抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)生長發(fā)育、調(diào)整機(jī)體代謝等多種功效[7]。若能夠通過安全有效的處理方法提取制備松花肽，不僅能夠更充分開發(fā)松花粉中大量?jī)?yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，也能有效增加松花粉中營養(yǎng)成分的利用率[8]。因此，開發(fā)具有清除自由基作用的抗氧化松花肽具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 松花分離蛋白，山東煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司；超氧陰離子自由基檢測(cè)試劑盒、羥自由基檢測(cè)試劑盒、DPPH自由基試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測(cè)試劑盒、谷光甘肽過氧化物酶（GSH-px）活力檢測(cè)試劑盒及丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒，南寧建成生物工程有限公司；胰酶，南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、硫化鈉等常用試劑均為分析純。Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-2010PC紫外分光光度計(jì)，尤尼克（上海）儀器有限公司；熒光顯微鏡，Olympus公司；SPF級(jí)Balb/c小鼠，山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同分子量松花肽的制備。

將松花分離蛋白加水配制成40 mg/mL的松花蛋白溶液，加入3 400 U/g胰酶，在pH 9，50 ℃的條件下分別酶解15、30、60、90、120、150、180、210和240 min后，100 ℃水浴中終止反應(yīng)，并通過高效液相色譜法（HPLC）驗(yàn)證其平均分子量。

1.2.2 分子量分布的測(cè)定。

使用TSK GEL G3000PWXL色譜柱，通過高效液相色譜測(cè)定9種松花肽的分子量分布。檢測(cè)條件：以體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸（TFA）混合溶液為流動(dòng)相，按0.5 mL/min的流速過柱，紫外檢測(cè)波長為225 nm。取牛血清蛋白、VB12、谷胱甘肽及膠原蛋白樣品各1 mg，分別溶于1 mL的純水中，用0.45 nm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。HPLC結(jié)果通過GPC軟件進(jìn)行分子量分布和平均分子量的分析。

1.2.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定。

松花肽清除超氧陰離子自由基的能力采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基對(duì)自氧化有催化作用。選擇超氧陰離子自由基試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以蒸餾水代替樣品做空白組，按下式計(jì)算清除率。

超氧陰離子自由基清除率=（A空白-A樣品）A空白×100%

式中，A樣品、A空白分別為樣品和空白的吸光值。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定。

松花肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力采用酶標(biāo)儀法測(cè)定，選擇南京建成的DPPH 自由基檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在517 nm 波長下測(cè)定。按下式計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率=1-Ap-AcAmax×100%

式中，Ap為樣品和 1 mmol/mL DPPH 自由基反應(yīng)后的吸光值；Ac為不加 DPPH 自由基時(shí)樣品的吸光值；Amax為加 DPPH 自由基但不加樣品 （以80% 甲醇代替樣品） 的吸光值。

1.2.5 羥自由基清除率的體外測(cè)定。

松花肽樣品的羥自由基清除能力采用羥自由基檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在波長 520 nm 處測(cè)定吸收度。 空白組以蒸餾水代替供試樣品，并按下式計(jì)算清除率。

羥自由基清除率=（A樣品-A空白）（A對(duì)照-A空白）×100%

式中，A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照的吸光值。

1.2.6 動(dòng)物分組與計(jì)量選擇。

選用SPF級(jí)，8～12個(gè)月的老齡Balb/c小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。在1～3 kD 和< 1 kD 2個(gè)區(qū)間內(nèi)分別選擇一種體外抗氧化效果較好的松花肽，各設(shè)3個(gè)劑量組，試驗(yàn)樣品的推薦用量為每人每日 6.0 g，每人按60 kg 體重計(jì)，相當(dāng)于 0.1 g/（d·kgBW），按人體推薦量的 5、10、20 倍確定小鼠的低、中、高劑量，即各組小鼠每日劑量分別為0.5、1.0、2.0 g/kgBW。按照《保健食品評(píng)價(jià)與檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》[9]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以人體食用推薦量的10倍為中劑量組；另設(shè)2個(gè)劑量組分別為人體推薦劑量的5倍和20倍；另有一個(gè)空白對(duì)照組，以大豆肽為陽性對(duì)照組，將該試驗(yàn)老齡小鼠分成8組，每組10只，分別連續(xù)灌胃對(duì)應(yīng)樣品30 d后，眼球取血，分離得到血清，用于后續(xù)血清中抗氧化酶活力及脂質(zhì)氧化的檢測(cè)。

1.2.7 小鼠血清MDA含量的測(cè)定。

各組老齡小鼠連續(xù)灌胃對(duì)應(yīng)樣品30 d后，眼球取血，分離得到血清，通過測(cè)定血清中MDA的含量分析2種松花肽對(duì)老齡Balb/c小鼠體內(nèi)MDA含量的影響。MDA是通過MDA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，分別設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管和對(duì)照管，在波長532 nm 處測(cè)定各組吸光值，平行 3 次，并按下式計(jì)算MDA含量。

MDA含量（nmol/mL）=測(cè)定OD值-對(duì)照OD值標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品（10 nmol/mL）×樣品稀釋倍數(shù)

1.2.8 小鼠血清的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的測(cè)定。

各組老齡小鼠連續(xù)灌胃對(duì)應(yīng)樣品30 d后，取肝臟組織勻漿后，測(cè)定各組小鼠肝臟T-SOD活力，分析2種松花肽對(duì)Balb/c小鼠體內(nèi)SOD活力的影響。T-SOD的測(cè)定是通過T-SOD活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，分別設(shè)定測(cè)定管和對(duì)照管，在波長550 nm 處測(cè)定吸光值，平行做3 次取平均值，按下式計(jì)算T-SOD活力。

T-SOD活力（U/mL）=對(duì)照OD值-測(cè)定OD值對(duì)照OD值÷50%×體系稀釋倍數(shù)×樣品稀釋倍數(shù)

1.2.9 小鼠血清GSH-Px活力的檢驗(yàn)。

測(cè)定各組小鼠血清中GSH-Px活力，分析2種松花肽對(duì)Balb/c小鼠體內(nèi)GSH-Px活力的影響。GSH-Px的測(cè)定是通過GSH-Px活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，分別設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、非酶管和酶管，在波長412 nm 處測(cè)定各組吸光值，平行做 3 次取平均值，并按下式計(jì)算GSH-Px活力。

GSH-Px活力=非酶管OD值-酶管OD值標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值×標(biāo)準(zhǔn)品（20 nmol/mL）×稀釋倍數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Origin 8.0作圖，SPSS軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 松花肽的分子量分布

首先通過HPLC和GPC軟件分析了不同酶水解時(shí)間9種松花肽的平均分子量和相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果如表1所示。9種松花肽的平均分子量在561～2 100 Da，并且隨著酶解時(shí)間的增加，松花肽的平均分子量逐漸減小，較大分子量（>5 kD）的肽段含量逐漸降低，而短肽（<0.3 kD）的比例逐漸增加。

2.2 松花肽的體外抗氧化活性

通過體外抗氧化試驗(yàn)分析9種不同分子量松花肽的超氧陰離子自由基清除率，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)松花肽濃度為5 mg/ mL時(shí)，9種松花肽的超氧陰離子自由基清除能力均顯著高于松花蛋白（P<0.05）。且隨著酶解時(shí)間的增加，得到松花肽的超氧陰離子自由基清除能力先增加后降低，酶解90 min時(shí)得到的松花肽具有最強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力。即酶解90 min，平均分子量為1 561 Da的松花肽超氧陰離子自由基清除率為34.8%。

9種松花肽對(duì)DPPH自由基清除能力的結(jié)果如圖2所示。當(dāng)松花肽濃度為5 mg/ mL時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，得到的松花肽清除DPPH自由基的能力逐漸增加，酶解240 min時(shí)得到的松花肽DPPH清除率最高。除酶解15 min的松花肽外，8種松花肽的DPPH自由基清除率均顯著高于松花蛋白（P<0.05），其中酶解90和240 min得到的松花肽的DPPH自由基清除能力最高，分別為75.6%和77.8%。

圖3顯示了9種松花肽的羥自由基清除能力。當(dāng)控制各松花肽濃度為5 mg/ mL時(shí)，與未酶解的松花蛋白相比，9種松花肽的羥自由基清除率均顯著增高（P<0.05）。且隨著酶解時(shí)間的增加，得到的松花肽抑制羥自由基的能力逐漸增加，酶解240 min時(shí)得到的松花肽的羥自由基清除率最高，為86.8%。

綜合分析以上9種不同分子量松花肽的體外抗氧化能力，選擇超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除能力最高的酶解90 min松花肽（1 565 Da）和羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力最高的酶解240 min松花肽（561 Da）作為1～3 kD 和< 1 kD 2個(gè)分子量區(qū)間松花肽的代表，進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)。

2.3 松花肽對(duì)老齡小鼠脂質(zhì)過氧化的影響

該研究選擇體外抗氧化試驗(yàn)中篩選出的1～3 kD 和< 1 kD 2種分子量的松花肽，使用老齡小鼠，連續(xù)灌胃30 d后，眼球取血，測(cè)血中MDA含量變化，分析松花肽對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的影響，結(jié)果如圖4所示。與陰性對(duì)照相比，<1 kD松花肽低、中劑量組，1～3 kD松花肽中、高劑量組的MDA含量極顯著降低（P<0.05），說明2種松花肽具有抗脂質(zhì)氧化活性。

2.4 松花肽對(duì)老齡小鼠SOD活力的影響

SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。圖5顯示了2種分子量的松花肽對(duì)老齡小鼠肝臟中T-SOD活力的影響。與陰性對(duì)照相比，除<1 kD松花肽高劑量組的SOD酶活力顯著升高（P<0.5）外，其他試驗(yàn)組以及大豆肽的SOD酶活力均極顯著增加（P<0.05），說明陽性對(duì)照和2個(gè)分子量松花肽均具有SOD抗氧化活性。

2.5 松花肽對(duì)老齡小鼠GSH-Px活力的影響

一般認(rèn)為，GSH-Px是一種可以在細(xì)胞內(nèi)清除有害過氧化物代謝產(chǎn)物的酶，能夠阻斷脂質(zhì)過氧化的連鎖反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。因此，分析了2種分子量的松花肽對(duì)老齡小鼠血清中GSH-Px活力的影響，結(jié)果如圖6所示。與陰性對(duì)照相比，<1 kD松花肽和1～3 kD松花肽的3個(gè)劑量組以及陽性對(duì)照的GSH-Px活力均極顯著增加（P<0.05）。

綜合老齡小鼠體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果可得，2種分子量的松花肽均具有體內(nèi)抗氧化活性。因此，松花肽可作為一種天然抗氧化劑及抗氧化活性成分，被應(yīng)用于功能食品及保健品的研究與開發(fā)中。

3 結(jié)論

該研究對(duì)松花肽的抗氧化性進(jìn)行了體內(nèi)和體外的研究。體外部分，研究了9種不同分子量松花肽的體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)添加量為5 mg/mL 時(shí)，平均分子量1 565 D松花肽的超氧陰離子自由基清除能力最高（34.8%），而561 D松花肽的羥自由基清除能力（86.8%）和DPPH自由基清除能力（77.8%）最高。體內(nèi)部分，研究了以上體外試驗(yàn)中效果最好的2種松花肽對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影響，發(fā)現(xiàn)這2種松花肽均能夠顯著增加T-SOD活力和GSH-Px活力，并降低MDA的含量，滿足《保健食品評(píng)價(jià)與檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》中抗氧化功能的判定要求。綜上所述，2種松花肽均具有顯著的抗氧化活性。

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