蔣太白 林思 周曦曦?┩踅?喜

摘要 [目的]建立HPLC測定苗藥夜寒蘇中異姜花素D含量的方法，并考察其提取方法。[方法]采用Waters symmetry shieldTM RP 18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈-水溶液為流動相進行梯度洗脫；流速0.5 mL/min；檢測波長233 nm。[結果]異姜花素D的分離度良好，在2.046～204.600 μg/mL（r=0.999 8）呈良好的線性關系，平均回收率為96.55%（RSD=1.9）。[結論]該研究所建立的方法簡單、穩(wěn)定性和重復性好，可用于黃姜花中異姜花素D的快速檢測。

關鍵詞 夜寒蘇；異姜花素D；提??；含量測定

中圖分類號 R284 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）27-0183-03

Extraction and Determination of Isoflavone D in Rhizoma hedychii

JIANG Taibai1，LIN Si2，ZHOU Xixi1 et al

（1.Institute of Traditional Medicine of Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture，Kaili，Guizhou 556000；2.Department of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550002）

Abstract [Objective] The research aimed to establish a HPLC method for the determination of isochelon D in Rhizoma hedychii，and to investigate its extraction method.[Method]Chromatagraphic experiments were carried out on a Waters symmetry shieldTM RP 18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm），gradient elution was carried out with acetonitrilewater solution as mobile phase；the flow rate was 0.5 mL/min；the detection wavelength was 233 nm.[Result]The separation of isochelon D was good，and it showed a good linear relationship at 2.046～204.600 μg/mL （r=0.999 8），and the average recovery was 96.55% （RSD=1.9）.[Conclusion]The method is simple，repeatable and stable，which could be used for quality control of isocoronarin D from Rhizoma hedychii.

Key words Rhizoma hedychii；Isocoronarin D；Extraction；Content determination

基金項目 貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術研究項目（QZYY2015090）。

作者簡介 蔣太白（1989—），男，苗族，貴州凱里人，執(zhí)業(yè)中藥師，碩士，從事民族醫(yī)學研究。*通訊作者，主管中藥師，碩士，從事民族醫(yī)藥研究。

收稿日期 2018-05-16

苗藥夜寒蘇（Rhizoma hedychii）是姜科姜花屬植物黃姜花（Hedychium flavum Roxb.）的根莖，主要用于治療虛弱自汗、胃氣虛弱、消化不良等癥[1]，該藥收載于《貴州草藥》和《中華本草》[2]中。主要產地為我國云貴川地區(qū)，印度亦有分布[3]。目前研究表明，姜花屬植物富含揮發(fā)油，還有香豆素類、黃酮類、雙黃酮類、多種萜類（單萜、倍半萜及二萜類等）化合物[4-9]。王進喜等[10]從夜寒蘇中分離到了多種半日花烷二萜類化合物，其中異姜花素D（isocoronarin D）含量較高?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，異姜花素D可以激活抗氧化反應元件[11-14]。筆者對苗藥夜寒蘇藥材中具有抗氧化活性物質的含量進行分析，為該藥材的后續(xù)開發(fā)及質量標準的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。試驗藥材（共10批）采于貴州省黔東南州各地，經貴陽中醫(yī)學院王祥培教授鑒定為姜科姜花屬植物黃姜花（Hedychium flavum Roxb.），具體見表1。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配Waters e2696 PDA檢測器（美國waters公司）；梅特勒-托利多 XA105DU電子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；SK7200HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；DHG9070B型恒溫鼓風干燥箱（上?，槴\實驗設備有限公司）。

1.1.3 主要試劑。異姜花素D對照品由黔東南州民族醫(yī)藥研究院實驗室自制，純度經HPLC面積歸一化法測定，含量>98%，使用前置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重。甲醇、乙腈（霍尼韋爾貿易（上海）有限公司，色譜純）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。稱取異姜花素D對照品適量，精密稱定，加色譜甲醇配制成含異姜花素D 204.6 μg/mL的對照品儲備液。

1.2.2 供試品溶液的制備。取本品粉末（過3號篩）約5.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇30 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率150 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放至室溫，再稱定質量，用無水乙醇補足損失的質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3 色譜分析條件。采用Waters symmetry shieldTM RP 18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm） （美國waters公司），流動相為乙腈（D）-水（A），流速1.0 mL/min，梯度洗脫（0～30 min，60% D；30～40 min，100% D；40～60 min，100% D）；柱溫15 ℃；檢測波長225 nm；進樣量10 μL。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應性試驗。取供試品溶液1 mL，在 “1.2.3” 色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應性。

1.2.4.2 線性關系考察。精密吸取對照品儲備液，使之配制成204.600、102.300、20.460、10.230、2.046 μg/mL的對照品溶液。取各濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，在 “1.2.3” 項色譜條件下，測定峰面積。以各對照品峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.3 精密度試驗。取同一份對照品溶液，在 “1.2.3” 項色譜條件下，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，并計算峰面積的RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液1 mL，室溫分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后進樣，記錄峰面積，計算峰面積的RSD。

1.2.4.5 重復性試驗。取同一批黃姜花藥材粉末約5.0 g，共6份，按 “1.2.2” 方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL進樣，測定峰面積，計算含量。

1.2.4.6 加樣回收試驗。精密稱取已知含量的同一批樣品9份，每份約5.0 g，分為3組，每組分別加入樣品含量一半的80%、100%、120%對照品溶液。按 “1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3” 項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。

1.2.5 樣品含量測定。精密稱取10批黃姜花樣品5.0 g，分別按 “1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3” 項下色譜條件進行測定，計算各供試品中異姜花素D的含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 系統(tǒng)適應性試驗。由圖1可見，在 “1.2.4.1” 條件下，樣品中各待測組分與相鄰峰的分離度均>1.5，拖尾因子在0.95～1.05，塔板數(shù)按異姜花素D峰計算不低于4 000。異姜花素D出峰時間為40.22 min。

2.1.2 線性關系考察。按 “1.2.4.2” 方法操作，以各對照品峰面積為縱坐標（Y）、對照品濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得出線性回歸方程為Y=22.699X+3.3385（R2=0.999 8），表明各化合物在相應濃度范圍內線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗。按照 “1.2.4.3” 方法操作，得出異姜花素D的峰面積均值為1 101.29，峰面積的RSD為1.7%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。按照 “1.2.4.4” 方法操作，得出異姜花素D的峰面積均值為1 211.49，峰面積的RSD為1.9%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗。按照 “1.2.4.5” 方法操作，計算得出異姜花素D含量的RSD為2.0%，表明方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收試驗。按照 “1.2.4.6” 方法操作，結果顯示（表2），異姜花素D的平均加樣回收率為96.55%，RSD為1.9%，表明方法的準確度良好。

2.2 樣品含量測定 由表3可知，此次采集到的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量差異較明顯，不同地點采集的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量最高的為0.638 5 μg/g，最低為0.031 4 μg/g，兩者相差20倍。秋冬季節(jié)采集的樣品中姜花素D含量明顯高于夏末采集的樣品。

3 討論與結論

為了確保最大量地提取出異姜花素D，分別考察了超聲、加熱回流、冷浸3種提取方式，不同濃度的甲醇、乙醇等溶媒，提取時間以及提取溶劑體積。通過比較，最終的提取方案為：黃姜花藥材粉末（過40目篩）約5 g，精密加入30 mL無水乙醇，稱定重量，超聲提取30 min，靜置后補足重量，濾過，濾液作為供試品溶液。

在色譜條件的選擇過程中，分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水等流動相，結果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水溶液梯度洗脫分離效果好，能使異姜花素D達到基線分離。此外，在檢測波長的選擇時，對異姜花素D待測成分在200～400 nm進行紫外全波長掃描后發(fā)現(xiàn)，異姜花素D在225 nm處整體紫外吸收良好，因此最終選擇225 nm作為檢測波長。

該研究所用樣品分別采至貴州省黔東南州各個地區(qū)。通過分析發(fā)現(xiàn)，收集到的藥材中均含有異姜花素D。此外采集到的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量差異較明顯，不同地點采集的夜寒蘇藥材中異姜花素D含量最高的為0.638 5 μg/g，最低為0.031 4 μg/g，兩者相差20倍。秋冬季節(jié)采集的樣品中姜花素D含量明顯高于夏末采集的樣品，此外貴州黔東南州地貌屬于我國西部高原山地，地勢西高東低，自東南部向北、東、南三面傾斜。特定的地理位置和復雜的地形地貌，使貴州的氣候和生態(tài)條件復雜多樣，在此狀態(tài)下夜寒蘇的生長受多方面的影響，因此該成分在藥材中含量差異較為明顯。

該試驗采用HPLC法測定黔產夜寒蘇中異姜花素D含量，線性關系良好，相關系數(shù)均在0.999 8以上，精密度、重復性、回收率符合含量測定要求，樣品穩(wěn)定性好。

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