袁朗 胡金成 張敬峰 張曉曦 孫華偉

摘要 [目的]研究豬偽狂犬病毒在江蘇省的遺傳變異情況。[方法]對2016年1-12月江蘇不同地區(qū)42家規(guī)模豬場采集或者送檢的共2365份病料組織進行PCR檢測，分析不同季節(jié)、豬場規(guī)模以及地區(qū)的檢測結(jié)果，并把檢測出的部分基因序列進行同源性分析。[結(jié)果]豬偽狂犬陽性樣品364份，陽性率為15.4%；夏、秋兩季的病原陽性率均低與春、冬兩季；蘇北以及蘇中地區(qū)的病原陽性率高于蘇南地區(qū)；不同規(guī)模的豬場病原陽性率隨著豬場規(guī)模的擴大逐漸下降且趨勢明顯。11株分離株中PRV-6分離株與Barthak61疫苗株屬于同一個分支。[結(jié)論]該研究可為江蘇省乃至全國豬偽狂犬病的防控提供參考。

關鍵詞 豬偽狂犬病毒；病原學；監(jiān)測；變異性

中圖分類號 S855文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0091-03

Abstract [ Objective]The aim is to study genetic variation of rabies virus in Jiangsu Province.[Method] PVR detection of 2365 histopathology sampling and submittal for inspection from 42 large-scale pig farms was carried out in Jiangsu area during Jan.-Dec.2016.Test result was analyzed in different seasons，large-scale pig farms and areas.Homology of determined part of gene sequence was analyzed.[Result] Male samples of Porcine pseudorabies were 364.Positive rate was 15.4%.Positive rate of pathogen in summer and autumn was higher than that of winter and spring.Positive rate of Northern Jiangsu and Central Jiangsu Region was higher than that of Southern Jiangsu.Positive rate of pathogen decreased with expanding large-scale pig farms.PRV-6 isolates of 11 isolates and Barthak61 Vaccine strain belong to the same branch.[Conclusion]The research can provide reference for preventing and controlling Porcine pseudorabies of Jiangsu and the whole country.

Key words Rabies virus；Etiology；Monitoring；Variability

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PRV）感染引起的以發(fā)熱、腦脊髓炎為典型癥狀，且嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一類傳染病[1]。從1813年美國發(fā)生以來，目前偽狂犬病已呈全球性分布，流行愈來愈嚴重，并造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。偽狂犬病在我國流行仍然普遍[3]，可致潛伏感染[4]。目前，豬偽狂犬病已被列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃》（2012—2020年）重點優(yōu)先防治的疫病，其控制目標是：到2015年原種豬場達到凈化標準，到2020年全國所有種豬場達到凈化標準[5]。通過對2016年江蘇省部分豬場PRV病原陽性率進行分析及對分離毒株開展遺傳變異研究，根據(jù)監(jiān)測和研究結(jié)果對PRV在江蘇省內(nèi)的流行和遺傳變異情況進行分析，為江蘇省乃至全國有效防控PRV提供技術(shù)儲備和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料組織。

病料來自于2016年1—12月江蘇不同地區(qū)42家規(guī)模豬場采集或者送檢的豬的器官組織（包括腦、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)等）。將這些病料組織用組織剪剪取部分，放在研磨器中，加入少許PBS充分研磨，將研磨好的濾液倒入EP管中，放入-20 ℃冰箱冷凍保存，進行凍融，每隔40 min左右解凍，然后再放入冰箱中冷凍，如此反復2～3次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要器材。PCR儀（Applide Biosystems），購自ABI公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng)（2500）；電泳儀（cavoy），購自凱元信瑞儀器公司；冷凍離心機型號為Centrifuge5424R，產(chǎn)自德國；其他化學試劑為進口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；各種規(guī)格移液器，購自德國Eppendorf公司。

1.1.3 主要試劑及引物。

①核算提取及PCR試劑盒。AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒購自康寧公司；PCR試劑盒等購自上海Sangon公司。②引物。

根據(jù)相關文獻設計引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，該對引物的擴增目的片段大小為272 bp（表1）。

1.2 方法

PRV核算的提取及PCR過程嚴格按照Sangon公司的試劑盒說明書進行相關操作；基因組測序送往南京金斯瑞公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 江蘇省不同地區(qū)42家豬場的病原檢測結(jié)果 2016年全年采集或者送檢的豬偽狂犬樣品共2356份，結(jié)果豬偽狂犬陽性樣品364份，陽性率為15.4%。表明來自這42家規(guī)模不一的豬場總體感染水平較低，這可能是區(qū)域流行的的特點或者江蘇近幾年對豬偽狂犬的防控做的相對較好。

2.2 2016年4個季度豬偽狂犬陽性率狀況及變化趨勢

2.2.1 季節(jié)差異不明顯。

從圖1可以看出，2016年江蘇省4個季度的偽狂犬陽性檢出率各不相同，春季在10%以下，其他3個季度均達到15%，其中以冬季和夏季最高，分別達到了19.3%和17.2%?？梢妭慰袢≡?～4季度的變化有一定的差異性，但是差異性不顯著。似乎季節(jié)對其感染狀況影響不大，全年保持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)；另外這也可能與樣本基數(shù)不夠大或者病料來源的差異性有一定關系。

2.2.2 地域特點對病原感染的影響。

從圖2可以看出，在蘇北、蘇中、蘇南的陽性檢出率依次為15.3%、18.2%、12.6%。其中，蘇中地區(qū)高于蘇北和蘇南地區(qū)，江蘇南部陽性率最低。這可能與豬場空間分布有關，從江蘇地區(qū)養(yǎng)殖特點來看，蘇中地區(qū)和蘇北地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)較蘇南密集，被感染的幾率也相對較大，應當重點檢疫和防控，尤其是蘇中地區(qū)，3個地區(qū)雖然存在一定的差異性，但是總體上的感染情況相對穩(wěn)定。

2.2.3 不同規(guī)模豬場對病原感染的影響。

把檢測樣品所在的豬場規(guī)模分為100頭以下、100～300頭、300～1 000頭、1 000頭以上進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖3。由圖3可知，規(guī)模在100頭以下的豬場陽性率為21.5%，100～300頭的陽性率為19.3%，300～1 000頭的陽性率為12.9%，1 000頭以上陽性率為7.8%。不同規(guī)模豬場的偽狂犬陽性率有顯著的差異性，并且隨著豬場規(guī)模的不斷增大，陽性率總體呈下降的趨勢。這可能與不同規(guī)模豬場的管理或者免疫程序有關。

小規(guī)模豬場相對大規(guī)模豬場管理不完善，如引進種豬的時候未嚴格進行篩選檢疫導致陰性豬場被陽性豬污染，或者檢疫疫程序不完善、不合理，有的豬場甚至未進行檢疫，有時帶毒豬未被及時淘汰導致其他陰性豬也被感染，有些豬場進行免疫接種時不能跟換針頭，偽狂犬通過針頭傳播給陰性豬，導致陽性感染范圍擴大。

2.2.4 2015年低于2016年的可能原因。與2015年相比，2016年偽狂犬陽性率有所上升，增長了6.4%。有可能是2年間豬場的免疫狀況、飼養(yǎng)環(huán)境、引種差異以及病毒流行狀況及變異等因素造成的差異。但總體上來說，2016年的感染程度較2015年嚴重，應當引起重視。影響病毒感染的因素是多樣的，應該多方面制定防控措施。

2.3 部分病原基因組的測序及分析

PRV gD 基因部分序列同源性及進化樹分析（圖4和圖5）。

圖4表明，11株PRV流行株的 gD 基因部分序列的同源性在98.6%～100%。其中，豬偽狂犬病毒分離株和Barthak 61疫苗株的同源性在98.1%～99.5%。圖5表明，11株PRV流行株的gD基因部分序列中，PRV-6分離株與Barthak61疫苗株屬于同一個分支，其他分離株共同組成另一分支。說明偽狂犬病毒存在一定程度上的變異，疫苗株對當前流行株的保護性可能有所下降。

3 結(jié)論

小規(guī)模豬場帶毒問題普遍，科學規(guī)范的管理以及合理的免疫程序應當是其借鑒學習大規(guī)模豬場的目標。小規(guī)模豬場由于缺少檢測平臺的依托，或者對檢測平臺的不信任導致帶毒豬不能及時被發(fā)現(xiàn)，這也為該病的防治帶來一定的難度。

在對PRV gD基因部分序列同源性及進化樹分析發(fā)現(xiàn)，在11個分離株中只有1株病毒與疫苗株處于同一個分支，其他毒株都屬于另一個分支，說明偽狂犬病毒存在一定程度上的變異，疫苗株對當前流行株的保護性可能有所下降。因此，加強野毒監(jiān)測十分重要，及時發(fā)現(xiàn)變異株對疫苗的研究很有幫助，這也能盡快適應豬偽狂犬流行的新形式。該病自2012年以來在我國流行趨勢逐年上升，江蘇地區(qū)2016年偽狂犬感染率也高于上一年，這與我國整體的流行趨勢一致，所以更應該加強該病的防控。

在種豬場，公豬是PRV的重要感染源，加強對帶毒公豬的監(jiān)測與淘汰，同時確保引進健康的陰性后備公豬進行擴群。有些豬場在引種時不謹慎，引進陽性種豬導致偽狂犬暴發(fā)或轉(zhuǎn)陽。有研究提出了“免疫→檢測→淘汰→補充陰性后備豬→免疫→測→淘汰”的凈化措施[6]，所以檢測與淘汰在防控中相當關鍵。在制定防控措施時，應該加強與全國其他地區(qū)的交流，不能只局限于江蘇地區(qū)以內(nèi)，從整體再到特定區(qū)域考慮，這樣對偽狂犬的防控會更有利。

參考文獻

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997.

[2] TAMBA M，CALABRESE R，F(xiàn)INELLI E E，et al.Risk factors for Aujeszky's-disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J].Prev Vet Med，2002，54（3）：203-212.

[3] 馬林風.豬偽狂犬病的流行現(xiàn)狀及防控措施[J].中國動物保健，2014（7）：46-47.

[4] 袁紅，練斯南，張衡，等.新型豬偽狂犬病流行情況及凈化措施[J].中國動物檢疫，2016，33（3）：58-62.

[5] 李達，馬萍，湯德元，等.規(guī)?；i場豬瘟和偽狂犬病的凈化方案 [J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（7） ：119-123.

[6] 孫華偉，趙永前，張敬峰，等.豬偽狂犬病的凈化策略[J] . 豬業(yè)科學，2016，33（1）：59-61.