黃艷 黎慧 李斌 劉盼 邵晨 王宇

摘要 [目的]探明氨氮脅迫對虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）的毒性效應(yīng)。[方法]采用96 h靜態(tài)毒性試驗(yàn)法研究了不同濃度和不同暴露時間的氨氮對虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）的影響。[結(jié)果]隨暴露時間的增加，Glu濃度出現(xiàn)顯著的先升后降，并在72 h后達(dá)到最大值；MetHb含量和BUN濃度則隨氨氮濃度的增加或者暴露時間的延長而增加；而BA則只在48～72 h的不同暴露時間下具有較大的變化。[結(jié)論]為降低氨氮對人工養(yǎng)殖虎紋蛙的影響，需要將養(yǎng)殖水體的氨氮濃度控制在59.46 mg/L以下。

關(guān)鍵詞 虎紋蛙；氨氮脅迫；血液生理生化指標(biāo)

中圖分類號 S947.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0087-04

Abstract [Objective] In order to understand the toxic effects of ammonia-N stress on blood physiological-biochemical indices of Hoplobatrachus chinensis .[Method] 96 h static toxicity tests in different concentrations and exposure time were used to evaluate the effects of ammonia-N on the concentration of blood glucose （Glu）， methemoglobin （MetHb）， blood urea nitrogen （BUN） and blood ammonia （BA）. [Result] With the exposure time increase， Glu concentration increased first and then decreased and it reached the maximum value at 72 h treatment；MetHb and BUN showed significant positive correlation with ammonia-N concentration or exposure time under the circumstance of the same exposure time or concentrations. Blood ammonia concentration changed significantly with exposing for 48-72 h. [Conclusion] It would be better to control the ammonia-N concentration under the safety level （59.46 mg/L） to reduce the effect of ammonia-N on breeding H.chinensis .

Key words Hoplobatrachus chinensis ；Ammonia-N stress；Blood biochemical indices

氨氮是養(yǎng)殖水體中最常見的污染物之一。在養(yǎng)殖過程中因投餌過多、養(yǎng)殖密度過大以及濫用殺菌劑和消毒劑等因素都會使水體中有機(jī)物含量增多，造成養(yǎng)殖水體氨氮的不斷累積，進(jìn)而對養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒害作用[1-2]。已有研究顯示，氨氮脅迫將導(dǎo)致養(yǎng)殖動物的鰓、腎和肝臟等器官發(fā)生病變[3-4]，包括引起鰓部潰爛，鰓小片顯著增厚，腎小管退化，腎小囊出現(xiàn)膨脹、囊腔充血和阻塞以及肝臟組織充血、退化、壞死等癥狀[5-7]。此外，動物機(jī)體的呼吸系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)也會受到氨氮的影響，引起免疫力下降，并導(dǎo)致動物體病原菌易感性增強(qiáng)，最終影響其生長和存活[1，8-12]。然而，上述關(guān)于氨氮脅迫對水生動物毒性的研究目前主要集中在魚類和甲殼動物，對兩棲動物的毒性效應(yīng)研究尚未見報(bào)道。兩棲動物是脊椎動物從水生過渡到陸生的重要類群，其生命活動的各個階段均離不開水環(huán)境。因此，以氨氮為代表的養(yǎng)殖水體污染可能是制約兩棲動物健康養(yǎng)殖的潛在重要因素。

虎紋蛙（ Hoplobatrachus chinensis ）是我國Ⅱ級保護(hù)野生動物，由于棲息地破壞及人類濫捕等因素導(dǎo)致其野生種群數(shù)量急劇下降。為滿足人類的消費(fèi)需求，目前虎紋蛙已在海南、廣東、浙江等地開展了產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。該研究擬以虎紋蛙為研究對象，采用96 h靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)法，通過研究不同濃度和不同暴露時間氨氮對虎紋蛙血糖（Glu）、高鐵血紅蛋白（MetHb）、尿素氮（BUN）和血氨（BA）含量變化的影響，以期為探討虎紋蛙的人工健康養(yǎng)殖和氨氮對兩棲動物的毒害機(jī)制提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用虎紋蛙種群來自浙江省金華市某虎紋蛙養(yǎng)殖場。試驗(yàn)前將體質(zhì)健康、規(guī)格相近[體重（181.17±1.36） g，體長（12.58±0.12） cm]的虎紋蛙成體置于水族箱（90 cm×40 cm×40 cm）中馴養(yǎng)7 d，控制水溫為（22±1）℃，pH為7.0±0.1，溶氧量為（8.7±0.1）mg/L。每24 h用曝氣脫氯的自來水換水1次，并定時投喂虎紋蛙專用飼料（漳州市聯(lián)泰飼料有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 半致死濃度試驗(yàn)。

在預(yù)試驗(yàn)確定虎紋蛙24 h全部死亡和96 h全部存活的氨氮濃度后，在該濃度范圍內(nèi)按照等對數(shù)梯度設(shè)計(jì)7個氨氮濃度組：220.00、293.37、391.22、521.70、695.70、927.73和1 237.15 mg/L，每個氨氮濃度設(shè)置2個平行組，同時設(shè)置空白對照組（0 mg/L）。氨氮溶液使用分析純NH4Cl配制，并采用納氏試劑法測定溶液的實(shí)際氨氮濃度，每24 h更換新配制的試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)中觀察記錄不同濃度組在不同時間（24、48、72 和96 h）各個體的活動狀況、中毒癥狀和死亡個體數(shù)量，并及時去除死亡個體。

1.2.2 暴露試驗(yàn)。

根據(jù)上述半致死濃度試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置4個氨氮濃度組：0、120、360和600 mg/L，其中0 mg/L為對照組，其他濃度為處理組，每組2個平行（30只/每平行），試驗(yàn)持續(xù)96 h。

1.3 血液樣品制備與檢測

暴露試驗(yàn)期間，分別于0、24、48、72和96 h在每個濃度組中隨機(jī)采集6只虎紋蛙樣本于冰上毀髓斷頭取血。將血液置于含有EDTA抗凝劑的2 mL無菌離心管中，4 ℃靜置12 h，3 500 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩lu、MetHb、BUN和BA的含量均使用南京建成生物工程研究所的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測定，測定方法和步驟參照試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以氨氮濃度和暴露時間作為自變量進(jìn)行雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），若二因素間無顯著交互作用，則進(jìn)行二因素的主效應(yīng)分析；若二因素間有顯著交互作用，則固定其中1個因素的水平，對另一個因素進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。用LSD多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平取 α =0.05。氨氮對虎紋蛙的96 h半致死濃度采用直線內(nèi)插法計(jì)算，以“96 h半致死濃度×0.1”作為其安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對虎紋蛙的半致死濃度

半致死濃度（LC50）是受試生物對毒性物質(zhì)的敏感性指標(biāo)，其值越小，生物體對毒物越敏感，毒物對生物的毒性也越強(qiáng)[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，虎紋蛙從自然水體轉(zhuǎn)入不同濃度的氨氮水體均表現(xiàn)出不同程度的中毒癥狀，其死亡率隨著氨氮濃度的增加或暴露時間的延長而遞增，其累積死亡率見圖1。氨氮對虎紋蛙的96 h半致死濃度和安全濃度分別為594.62和59.46 mg/L。

2.2 氨氮對虎紋蛙血液中部分生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 氨氮脅迫對虎紋蛙Glu的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙Glu的影響無顯著交互作用（ P >0.05），氨氮濃度對Glu無顯著影響（ P >0.05）（表1）。主效應(yīng)分析結(jié)果顯示，隨著暴露時間的延長，Glu先升后降。當(dāng)暴露時間達(dá)到72 h時，Glu顯著高于其他暴露時間（圖2）。

2.2.2 氨氮脅迫對虎紋蛙MetHb的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙MetHb的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時間均對MetHb有顯著影響（ P <0.05）（表1）。控制其中一個因素后所進(jìn)行的單因素方差分析結(jié)果顯示：在相同氨氮濃度下，MetHb隨著暴露時間的延長而顯著增加；而相同時間內(nèi)，MetHb隨著氨氮濃度的升高而顯著增加（圖3）。

2.2.3 氨氮脅迫對虎紋蛙BUN的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙BUN的影響有顯著交互作用（ P <0.05），氨氮濃度和暴露時間均對BUN有顯著影響（ P <0.05）（表1）。單因素方差分析結(jié)果顯示，在同一氨氮濃度下，BUN隨著暴露時間的延長而緩慢增加，96 h時增加顯著；而在同一暴露時間下，隨著氨氮濃度的增加，BUN在24 h時并未升高，而在48、72和96 h時則顯著升高（圖4）。

2.2.4 氨氮脅迫對虎紋蛙BA的影響。

氨氮濃度和暴露時間雙因素對虎紋蛙BA的影響無顯著交互作用（ P >0.05）（表1）。結(jié)果分析顯示，BA在不同氨氮濃度下，暴露組均顯著高于對照組，但暴露組之間無顯著性差異（圖5）；在不同暴露時間下，BA 96和72 h均顯著高于24和48 h，但96和72 h之間、24和48 h之間均無顯著差異（圖6）。

3 結(jié)論與討論

氨氮在水體中主要以離子氨（NH+4）、分子氨（NH3）和銨鹽等形式存在，是普遍存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的有害物質(zhì)。不同水生動物對氨氮毒性的敏感性存在較大差異，具有不同的耐受性[14-16]。研究表明虎紋蛙對氨氮的96 h半致死濃度和安全濃度均遠(yuǎn)高于虹鱒魚（ Oncorhynchus mykiss ）[14]、史氏鱘（ Acipenser schrencki ）[15]和克氏原螯蝦（ Procambarus clarkii ）[16]等魚類和甲殼動物，這可能與動物體自身的生理結(jié)構(gòu)和生活習(xí)性有關(guān)?；⒓y蛙屬于兩棲類，其生命活動雖然不能完全脫離水生環(huán)境，但其成體的主要呼吸器官肺對水體的依賴性要遠(yuǎn)小于魚類和甲殼類的水體呼吸器管鰓，因此完全生活于水中的魚類和甲殼類動物的氨氮脅迫半致死濃度要遠(yuǎn)大于半水棲的兩棲動物。

3.1 氨氮脅迫對虎紋蛙Glu的影響

動物的血液生理生化因子在正常情況下一般處于穩(wěn)定狀態(tài)，但在外界環(huán)境因素的脅迫下，其動態(tài)平衡可能會遭到破壞，并進(jìn)而導(dǎo)致正常生理功能的失衡。Glu作為動物體血液中的重要生化因子之一，其濃度的變化反映環(huán)境脅迫，如高密度放養(yǎng)、捕捉、裝載及運(yùn)輸?shù)鹊闹匾笜?biāo)[17-19]。該研究中虎紋蛙的Glu在氨氮脅迫下隨暴露時間逐漸增加，并在72 h后達(dá)到最大值，隨后又在96 h后恢復(fù)脅迫前水平。說明在氨氮脅迫初期，虎紋蛙應(yīng)對自身的能量分流和代謝調(diào)整產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激效應(yīng)，引起動物體額外的能量需求，糖異生作用加強(qiáng)，從而導(dǎo)致Glu升高[20]。而隨著脅迫時間的延長，蛙體的應(yīng)激效應(yīng)通過自身調(diào)節(jié)得到緩解，Glu恢復(fù)正常水平。該結(jié)果與氨氮急性脅迫對青魚（ Mylopharyngodon piceus ）Glu影響的研究結(jié)果一致[21]，說明氨氮脅迫能夠?qū)lu產(chǎn)生顯著影響。此外，該結(jié)果也說明Glu在動物體內(nèi)的變化具有時效性，僅能作為動物急性反應(yīng)的重要指標(biāo)。

3.2 氨氮脅迫對虎紋蛙MetHb的影響

MetHb是由血液中的血紅蛋白經(jīng)氧化轉(zhuǎn)變而來。正常情況下，動物體內(nèi)的MetHb含量極少，并處于不斷的生成與分解的動態(tài)平衡中。該研究虎紋蛙MetHb在氨氮脅迫下隨著暴露時間的延長或濃度的增加而顯著上升。表明在氨氮脅迫下，水體中的分子氨（NH3）因具有較高的脂溶性而極易穿透虎紋蛙的細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)，將血液中大量的血紅蛋白氧化為MetHb，降低血液的載氧能力[22]。觀察試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，虎紋蛙的游泳和跳躍能力隨著氨氮脅迫時間的延長或濃度的增大出現(xiàn)明顯減弱的現(xiàn)象，這與對鯰魚運(yùn)動能力[23]的研究結(jié)果相一致，說明氨氮脅迫可顯著增加MetHb在動物體內(nèi)的含量，降低其體內(nèi)的含氧量，進(jìn)而影響水生動物的呼吸系統(tǒng)，引發(fā)一系列的生理反應(yīng)，最終導(dǎo)致虎紋蛙的窒息和死亡。

3.3 氨氮脅迫對虎紋蛙BUN的影響

BUN是動物體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，可通過腎臟的過濾和重吸收作用而排出體外。然而，當(dāng)腎臟發(fā)生病變時，腎小球的濾過率快速下降，BUN將不能通過腎臟隨尿液排出體外，導(dǎo)致血液中BUN的含量升高，引起代謝絮亂[24]。因此，動物體血液中BUN的含量可用于反映腎臟的健康狀況。該研究中虎紋蛙BUN在氨氮脅迫下具有明顯的時間和劑量雙效應(yīng)，并與暴露時間的延長或濃度的升高呈正相關(guān)，結(jié)合相關(guān)研究推測氨氮脅迫可能對虎紋蛙的腎臟組織產(chǎn)生不同程度的損傷，如腎小管和動脈球的退化以及腎小囊的膨脹、阻塞、充血和出血等[6-7]。

3.4 氨氮脅迫對虎紋蛙BA的影響

BA是動物體內(nèi)各種氨基酸經(jīng)分解代謝產(chǎn)生的氨和腸管吸收的氨進(jìn)入血液所形成的，通常會維持一個相對較低的含量。然而，在外源性氨源或肝臟發(fā)生病變等情況下，動物體內(nèi)的BA含量會顯著上升。該研究虎紋蛙BA在氨氮脅迫下顯著增加，但不同濃度的氨氮對虎紋蛙BA的影響并無顯著差異；不同暴露時間對虎紋蛙BA變化的影響除48～72 h明顯外，其他時間均不顯著。該研究結(jié)果與氨氮脅迫對魚類BA的影響不同，并沒有出現(xiàn)BA隨著氨氮濃度增高和暴露時間的延長而呈顯著正相關(guān)[25]。推測這可能是虎紋蛙BA在外界氨氮刺激下達(dá)到一定閾值后，機(jī)體啟動自身調(diào)節(jié)機(jī)制來減少外源性氨氮的進(jìn)入、增加體內(nèi)氨氮的排泄以及生成谷氨酰胺和BUN等無毒物質(zhì)，并將其貯存在各組織中，使機(jī)體內(nèi)BA的積累量不再增加[26-28]，從而將BA穩(wěn)定在一定的水平。

動物的血液生理生化指標(biāo)可反映出該個體的健康狀態(tài)，該研究顯示氨氮脅迫對虎紋蛙血液中的Glu、MetHb、BUN和BA都具有一定影響。因此，控制虎紋蛙養(yǎng)殖水體中的氨氮濃度在安全范圍（< 59.46 mg/L）內(nèi)將有助于該物種的健康安全養(yǎng)殖。

參考文獻(xiàn)

[1] CAMARGO J A，ALONSO .Ecological and toxicological effects of inorganic nitrogen pollution in aquatic ecosystems：A global assessment[J].Environment international，2006，32（6）：831-849.

[2] ACKERMAN P A，WICKS B J，IWAMA G K，et al.Low levels of environmental ammonia increase susceptibility to disease in Chinook salmon smolts[J].Physiological and biochemical zoology，2006，79（4）：695-707.

[3] JIANG Q C，LV L L，JIANG G Z，et al.Acute effects of ammonia on antioxidative response and gill Na+/K+ ATPase activity of juvenile Australian red claw crayfish（ Cherax quadricarinatus ）[J].Journal of freshwater ecology，2012，27（4）：551-560.

[4] CHING B Y，CHEW S F，WONG W P，et al.Environmental ammonia exposure induces oxidative stress in gills and brain of Boleophthalmus boddarti（mudskipper）[J].Aquatic toxicology，2009，95（3）：203-212.

[5] SPENCER P，POLLOCK R，DUB M.Effects of un-ionized ammonia on histological，endocrine，and whole organism endpoints in slimy sculpin（ Cottus cognatus ）[J].Aquatic toxicology，2008，90（4）：300-309.

[6] PEYGHAN R，TAKAMY G A.Histopathological，serum enzyme，cholesterol and urea changes in experimental acute toxicity of ammonia in common carp Cyprinus carpio and use of natural zeolite for prevention[J].Aquaculture international，2002，10（4）：317-325.

[7] BENLI A K，KKSAL G，ZKUL A.Sublethal ammonia exposure of Nile tilapia（ Oreochromis niloticus L.）：effects on gill，liver and kidney histology[J].Chemosphere，2008，72（9）：1355-1358.

[8] JIANG L X，PAN L Q，XIAO G Q.Effect of ammonia-N immune parameters of white shrimp Litopenaeus van-namei [J].Journal of fishery sciences of china，2004，11（6）：537-541.

[9] PAUST L O，F(xiàn)OSS A，IMSLAND A K.Effects of chronic and periodic exposure to ammonia on growth，food conversion efficiency and blood physiology in juvenile Atlantic halibut（ Hippoglossus hippoglossus L.）[J].Aquaculture，2011，315（3/4）：400-406.

[10] ROMANO N，ZENG C S.Acute toxicity of ammonia and its effects on the haemolymph osmolality，ammonia-N，pH and ionic composition of early juvenile mud crabs， Scylla serrata（Forskl）[J].Comparative biochemistry and physiology part A：Molecular & integrative physiology，2007，148（2）：278-285.

[11] KOO J G，KIM S G，JEE J H，et al.Effects of ammonia and nitrite on survival，growth and moulting in juvenile tiger crab， Orithyia sinica（Linnaeus）[J].Aquaculture research，2005，36（1）：79-85.

[12] LIAO Y Y，WANG H H，LIN Z G.Effect of ammonia and nitrite on vigour，survival rate，moulting rate of the blue swimming crab Portunus pelagicus zoea[J].Aquaculture international，2011，19（2）：339-350.

[13] ZENG Y Y，LAI Z N，YANG W L，et al.Toxicities and potential ecological effects of copper and cadmium to natural fish larvae and juveniles from the Pearl River[J].Asian journal of ecotoxicology，2014，9（1）：49-55.

[14] CALAMARI D，GALASSI S，DA GASSO R.A system of tests for the assessment of toxic effects on aquatic life：An experimental preliminary approach[J].Ecotoxicology and environmental safety，1979，3（1）：75-89.

[15] LIU J K，LIU L Z，ZHAO W，et al.Acute toxicity and safe concentration of non-ionic ammonia and ammonia nitrogen to juvenile Amur sturgeon Acipenser schrencki with different sizes[J].Journal of dalian fisheries university，2014，29（2）：175-178.

[16] ZHONG J W，ZHU Y A，MENG Q L，et al.Basic components analysis and nutritive value evaluation of Scophthalmus maximus muscle[J].Journal of yangtze university（Natural science cdition），2013，10（8）：55-59.

[17] BARTON B A，IWAMA G K.Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids[J].Annual review of fish diseases，1991，1：3-26.

[18] MAI K S，AI Q H，XUE W，et al.Stress in aquaculture and its prevention with emphasis on nutritional methods[J].Periodical of ocean university of China，2004，34（5）：767-774.

[19] HONG L，ZHANG X M.Effects of environmental stress on plasma levels of glucose and ESR of Sebastes schlegeli and Lateolabrax maculatus [J].Journal of fishery sciences of China，2005，12（4）：414-418.

[20] LU S W，LIU Z P，YU Y.Effects of density stress on growth and metabolism of juvenile Epinephelus malabaricus [J].Journal of fishery sciences of China，2011，18（2）：322-328.

[21] HU Y，HUANG Y，ZHONG L，et al.Effects of ammonia stress on the gill Na+/K+-ATPase，microstructure and some serum physiological-biochemical indices of juvenile black carp（ Mylopharyngodon piceus ）[J].Journal of fisheries of China，2012，36（4）：538-545.

[22] LIU Y.Ammonia-N stress on Misgurnus anguillicaudatus and second generation population of mass selection[D].Suzhou：Soochow University，2011.

[23] WANG F，LIU H F，YANG L.Acute toxicity of nitrite nitrogen to goldfish juveniles[J].Fisheries science，2010，29（6）：369-371.

[24] YANG H C，CHUN S.Histopathological study of acute toxicity of ammonia on common carp（ Cyprinus carpio L.）[J].Bulletin of the korean chemical society，1986，19（3）：249-256.

[25] KNOPH M B，THORUD K.Toxicity of ammonia to Atlantic salmon（ Salmo salar L.）in seawater-effects on plasma osmolality，ion，ammonia，urea and glucose levels and hematologic parameters[J].Comparative biochemistry and physiology part A：Physiology，1996，113（4）：375-381.

[26] JOW L Y，CHEW S F，LIM C B，et al.The marble goby oxyeleotris marmoratus activates hepatic glutamine synthetase and detoxifies ammonia to glutamine during air exposure[J].Journal of experimental biology，1999，202（3）：237-245.

[27] IP Y，CHEW S，LEONG I，et al.The sleeper Bostrichthys sinensis（family eleotridae）stores glutamine and reduces ammonia production during aerial exposure[J].Journal of comparative physiology B，2001，171（5）：357-367.

[28] WANG Y X，WALSH P J.High ammonia tolerance in fishes of the family Batrachoididae（Toadfish and Midshipmen）[J].Aquatic toxicology，2000，50（3）：205-219.