符新歡 王珺 王永強 梁業(yè)松 陳國華 詹景福

摘要 [目的]為了提高熱帶四爿藻的生長速率。[方法]以“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”為基礎(chǔ)，分別添加有機碳（葡萄糖和乙酸鈉）對四爿藻進行自養(yǎng)、兼養(yǎng)及異養(yǎng)培養(yǎng)，篩選出促進四爿藻快速生長的培養(yǎng)模式，并通過單因子及正交試驗，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方。然后用優(yōu)化培養(yǎng)基與“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”對比培養(yǎng)四爿藻。[結(jié)果]乙酸鈉是四爿藻兼養(yǎng)培養(yǎng)的適宜有機碳，其最佳的乙酸鈉濃度為6 g/L。獲得了四爿藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)基為：6 g/L CH3COONa、50 mg/L NH2CONH2-N、2 mg/L Ca（H2PO4）2-P、1 mg/L FeSO4-Fe、1 mg/L Vitamin B1、0.000 5 mg/L Vitamin B12和0.5 mg/L Vitamin H。優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基與“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”對比培養(yǎng)四爿藻的結(jié)果表明，培養(yǎng)第7天，兼養(yǎng)培養(yǎng)收獲的藻細胞密度、干重分別達到3.84×106 cells/mL及1.14 g/L，分別是“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”的2.83倍、3.12倍。[結(jié)論]四爿藻進行兼養(yǎng)培養(yǎng)可獲得高密度培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞 四爿藻；兼養(yǎng)；培養(yǎng)基；生長

中圖分類號 Q949.2文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0080-04

Abstract [Objective]To improve the growth rate of Tetraselmis chui .[Method] Based on “Ningbo University#3 medium”， organic carbon （C6H12O6 and CH3COONa）was added for the autotrophic culture， mixed culture and heterotrophic culture， respectively ， and the mixotrophy medium of T. chui was further optimized by single factor test and orthogonal test. And then， the results of mixotrophic and autotrophic cultures were compared. [Result] CH3COONa was the better organic carbon applicable for the mixotrophic culture on T. chui . The optimization of mixotrophy medium was 6 g/L CH3COONa， 50 mg/L NH2CONH2-N， 2 mg/L Ca（H2PO4）2-P， 1 mg/L FeSO4-Fe， 1 mg/L Vitamin B1， 0.000 5 mg/L Vitamin B12 and 0.5mg/L Vitamin H. The cell density and dry weight of the “mixotrophy medium” was up to 3.84×106 cells/mL and 1.14 g/L after culturing seventh day， respectively， being 2.83/3.12 times higher than the cell density and dry weight of “Ningbo University #3” medium. [Conclusion] T. chui can be cultured with high cell density through mixotrophic culturing.

Key words Tetraselmis chui ；Mixotrophic culture；Medium；Growth

四爿藻（ Tetraselmis chui ）是綠藻門綠藻綱團藻目衣藻科四爿藻屬的一種運動很快的單細胞綠藻，能進行光合放氧作用，繁殖速度快，并含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是魚、蝦幼體和貝類的優(yōu)良餌料[1-3]。因四爿藻特殊的化學(xué)組成和系統(tǒng)位置，受到國內(nèi)、外學(xué)者的普遍關(guān)注[4]。目前，人工培養(yǎng)四爿藻技術(shù)已經(jīng)受到重視[5-8]。如何提高四爿藻細胞生長速率，縮短培養(yǎng)周期，是當(dāng)前需要致力解決的關(guān)鍵問題。微藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)由自養(yǎng)生長和異養(yǎng)生長兩部分組成，是在利用光能和CO2的同時，以有機碳作為補充碳源和能源的一種培養(yǎng)方法。微藻通過利用有機碳補充光能自養(yǎng)，兼養(yǎng)培養(yǎng)可提高微藻的生長速率[9-12]。在有機酸碳源中，最重要的是醋酸鹽，它比任何脂肪酸或其他有機酸更有效，是異養(yǎng)培養(yǎng)的良好碳源[13]。該試驗以常用的“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)液” [13]為基礎(chǔ)，分別添加不同質(zhì)量濃度的有機碳（葡萄糖和乙酸鈉）對四爿藻進行自養(yǎng)、異養(yǎng)及兼養(yǎng)培養(yǎng)，篩選出最佳的培養(yǎng)模式及有機碳種類、濃度。并在最優(yōu)培養(yǎng)模式下分別通過單因素和正交試驗研究不同種類及濃度的氮源、磷源、鐵源、維生素B1（VB1）、B12（VB12）及維生素H（VH）等主要營養(yǎng)元素對四爿藻生長速率的影響，篩選出最佳的培養(yǎng)基配方，旨在提高四爿藻的生長速率，為四爿藻的大規(guī)模高密度生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用四爿藻原種取自海南省陵水縣自然海區(qū)，經(jīng)過微吸管法分離挑取單個細胞，在“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)液”中進行無菌純化擴增培養(yǎng)。藻細胞長（11.5～16.5） μm，寬（7.5～9.5） μm，厚（4.3～5.5） μm；在細胞前端凹陷中伸出4根等長的鞭毛。試驗前進行無菌純培養(yǎng)藻種，取指數(shù)生長期的無菌藻株用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 藻體培養(yǎng)條件。試驗用海水取自海口市新埠島海區(qū)，海水鹽度32.5，pH 8.10，經(jīng)過500目篩絹網(wǎng)及脫脂棉花小水滴過濾，再煮沸滅菌，自然冷卻。試驗用培養(yǎng)瓶為250 mL齒輪牌三角瓶，經(jīng)過洗液消毒，洗滌、晾干，再經(jīng)130 ℃高溫滅菌2 h，自然冷卻后使用。試驗操作過程均在無菌條件下進行。試驗溫度為（26±0.5）℃，光強為3 500 lx，光照周期為14 L∶10 D。每天搖藻4次，并隨機交換試驗瓶位置，以減少光照誤差。

1.2.2 試驗設(shè)計。

1.2.2.1 單因子試驗。有機碳的篩選：以“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加有機碳進行異養(yǎng)及兼養(yǎng)培養(yǎng)，乙酸鈉設(shè)計的濃度梯度為0、3、6、9和12 g/L，葡萄糖設(shè)計的濃度梯度為0、10、15、20和25 g/L，篩選出適宜的有機碳及其最適濃度；采用以上試驗篩選出最適的培養(yǎng)模式及其有機碳源，以“寧波大學(xué)3#配方”為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別配制缺氮鹽、缺磷鹽、缺鐵鹽的培養(yǎng)液。氮源種類及質(zhì)量濃度的篩選：分別以硫酸銨（NH4）2SO4、硝酸鈉（NaNO3）、尿素（NH2CONH2）為氮源，其氮（N）的質(zhì)量濃度梯度分別為0、20、35、50、70 mg/L；磷源種類及質(zhì)量濃度的篩選：分別以磷酸二氫鉀（KH2PO4）、過磷酸鈣[Ca（H2PO4）2]為磷源，磷（P）的質(zhì)量濃度分別為 0、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/L；鐵源種類及質(zhì)量濃度的篩選：以硫酸亞鐵（FeSO4）及檸檬酸鐵（C6H5O7Fe）為鐵鹽，設(shè)置鐵（Fe）質(zhì)量濃度梯度為 0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mg/L。各試驗均設(shè)置2個水平。

1.2.2.2 維生素B1、B12和維生素H正交試驗。針對微藻對維生素的需求，設(shè)計三因素四水平正交試驗（表1）。

1.2.2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基驗證試驗。通過上述單一因素及正交試驗獲得適宜四爿藻生長繁殖的優(yōu)化培養(yǎng)基。選取優(yōu)化培養(yǎng)基與常用的“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”對比培養(yǎng)四爿藻，驗證優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。藻液接種密度、海水鹽度、pH、溫度與光照等培養(yǎng)條件保持一致，每天定時固定、計數(shù)，共培養(yǎng)7 d。

1.2.3 藻細胞密度計數(shù)。首先取一定量的四爿藻液稀釋成5個濃度梯度，用 722S 可見分光光度計分別測定吸光度，同時用 XB-K-25 血球計數(shù)板計數(shù)（計數(shù)用的藻液用少許甲醛固定，當(dāng)天計數(shù)，每瓶重復(fù) 2～3 次，取平均值），確定試驗藻液的藻細胞密度與OD值的線性關(guān)系。測定試驗藻液的OD值，根據(jù)OD值與藻細胞密度的關(guān)系換算成藻細胞密度。

1.2.4 藻細胞干重的測定。準確量取各試驗藻液50 mL，將其轉(zhuǎn)移至預(yù)先干燥過并已稱重的孔徑為 3 μm Whatman GF/C濾膜上抽濾收獲藻細胞，并用鹽度為5的水沖洗3次（避免超純水沖洗導(dǎo)致藻細胞破裂）。再將附有藻細胞的濾膜置于干凈稱量瓶（內(nèi)墊有已編號的錫箔紙）內(nèi)，置于恒溫干燥箱55～60 ℃烘干6 h后，用感量為0.1 mg的電子天平稱重，再次烘干，稱重，直至恒重。根據(jù)干藻重量和藻液體積計算出 1 L 藻液中的生物質(zhì)干重（g/L）。

1.2.5 比生長速率（ K）的計算。藻細胞的比生長速率（K）計算公式如下：

K=（ ln Wt- ln W0）/t

式中，W0：培養(yǎng)初始的藻細胞數(shù)；Wt：經(jīng)過t時間培養(yǎng)后的藻細胞數(shù)；t ：培養(yǎng)時間（d）。

1.2.6 統(tǒng)計分析。運用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖，并使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（方差分析、LSD多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因子試驗

2.1.1 有機碳的篩選。CH3COONa與C6H12O6對四爿藻自養(yǎng)、兼養(yǎng)和異養(yǎng)的生長效應(yīng)見圖1。由圖1可知，四爿藻既能夠進行光合自養(yǎng)生長，又可以在有光條件下利用有機碳源進行兼養(yǎng)生長，但幾乎不能在黑暗條件下進行異養(yǎng)生長；培養(yǎng)模式從優(yōu)到劣的順序為兼養(yǎng)、自養(yǎng)、異養(yǎng)；H3COONa為有機碳的培養(yǎng)效果優(yōu)于C6H12O6。試驗結(jié)果表明，添加乙酸鈉進行兼養(yǎng)培養(yǎng)的四爿藻細胞飽滿，平均大小比自養(yǎng)藻細胞大。經(jīng)單因素方差分析得知，添加6 g/L乙酸鈉對四爿藻的兼養(yǎng)生長有顯著影響（ P <0.05）。

2.1.2 氮源的篩選。從圖2可以看出，尿素、硝酸鈉、硫酸銨均可作為四爿藻的氮源。最適合四爿藻兼養(yǎng)生長的氮源為尿素，以50 mg/L 為最佳，其次為20 mg/L硫酸銨。經(jīng)單因素方差分析得知，3種氮源對四爿藻生長的影響均極顯著（ P <0.01）。

2.1.3 磷源的篩選。從圖3可以看出，磷酸二氫鉀和過磷酸鈣均可以作為四爿藻生長需要的磷源；最佳的磷質(zhì)量濃度為2.0 mg/L過磷酸鈣。經(jīng)單因素方差分析，磷源對四爿藻的生長有極顯著影響（ P <0.01）。

2.1.4 鐵源的篩選。從圖4可以看出，檸檬酸鐵和硫酸亞鐵均可作為四爿藻兼養(yǎng)培養(yǎng)的鐵源，其中以1.00 mg/L硫酸亞鐵為最佳。經(jīng)單因素方差分析，得知鐵源對四爿藻的生長有極顯著影響（ P <0.01）。

2.2 維生素B1、B12和維生素H正交試驗

通過正交試驗結(jié)果可知，試驗號10的組合最適合四爿藻的兼養(yǎng)培養(yǎng)，其質(zhì)量濃度分別為1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12和0.5 mg/L VH。（表2）。

2.3 優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基的驗證

優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基與“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”的對比培養(yǎng)試驗結(jié)果見圖5。從圖5可知，四爿藻在兼養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)基中顯示出較大的生長優(yōu)勢，從第2～7天，優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基比“寧波大學(xué)3#自養(yǎng)培養(yǎng)基”收獲四爿藻的生物量（細胞密度）分別提高了1.31、1.42、2.09、2.20、2.39和2.83倍。培養(yǎng)第7天，兼養(yǎng)四爿藻細胞密度達3.84×106 cells/mL，細胞干重為1.14 g/L。

3 討論

微藻需要從外界吸收營養(yǎng)元素來作為自身生長需要的必需元素，不同的微藻對營養(yǎng)元素的需求各不一樣。兼養(yǎng)培養(yǎng)由光合自養(yǎng)及異養(yǎng)兩部分組成，既可以利用光能，又可以利用有機碳源進行生長繁殖，兼養(yǎng)培養(yǎng)有機碳源提供的能量減輕了微藻的生長對光合作用的依賴，因而，有些微藻得到有機碳源后，生長發(fā)育更快、更好。

3.1 有機碳

有些微藻在得到有機質(zhì)后，生長更適宜[13]。龍元薷等[11]研究表明，雨生紅球藻（ Haematococcus pluvialis ）兼養(yǎng)比自養(yǎng)更有利于紅球藻細胞密度的增加，兼養(yǎng)生長的適宜乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.5 g/L，兼養(yǎng)培養(yǎng)的最大藻細胞密度可達自養(yǎng)培養(yǎng)的3.12倍。同時指出不同藻株對乙酸鈉的需求量并不一致，為了實現(xiàn)生物量的有效增加，需要對具體藻株添加適量的乙酸鈉。赫冬梅等[12]研究表明，隨著葡萄糖和乙酸鈉濃度的增加，湛江等鞕金藻（ I.zhanjianggensis ）的生長表現(xiàn)出先促進后抑制的現(xiàn)象，葡萄糖對生物量具有顯著促進作用的濃度為15 g/L，而乙酸鈉具有顯著促進作用的濃度為2.5～15.0 g/L。試驗結(jié)果表明，四爿藻可以利用乙酸鈉進行兼養(yǎng)生長，當(dāng)乙酸鈉的濃度在0～6 g/L時， K 值隨乙酸鈉濃度增大而增大，添加6 g/L 乙酸鈉K值達到最大值，為最佳添加量，當(dāng)乙酸鈉濃度在6～12 g/L 時， K 值隨乙酸鈉濃度的增大而減小，即有機碳濃度超出適宜濃度范圍時生長速率下降；四爿藻利用乙酸鈉進行兼養(yǎng)生長的能力是有限的。而該試驗設(shè)置的葡萄糖的添加未能促進四爿藻的生長。

3.2 氮鹽

氮是組成細胞生物膜、原生質(zhì)和細胞核的重要成分，在生命活動中有著特殊的作用[14]。在微藻生長繁殖過程中氮是最重要的大量元素之一，不同微藻對氮源的種類及濃度需求各異[13]。鄭曉宇等[15]研究表明，四尾柵藻（ Scenedesmus quadricauda ）最適生長的氮質(zhì)量濃度范圍為16～32 mg/L。宋邦興等[16]研究表明，翼繭形藻的（ Amphiprora alata ）最適生長的氮質(zhì)量濃度為 40 mg/L NaNO3-N。試驗結(jié)果表明，硝酸鈉、尿素、硫酸銨均能被四爿藻利用，其中以50 mg/L NH2CONH2-N為四爿藻兼養(yǎng)培養(yǎng)的最佳氮源，（NH4）2SO4-N 次之。（NH4）2SO4-N和NaNO3-N最佳的質(zhì)量濃度均為20 mg/L，高于或低于最佳質(zhì)量濃度的含氮量對四爿藻的生長均有不同程度的抑制作用，當(dāng)（NH4）2SO4-N的質(zhì)量濃度達50 mg/L時，四爿藻的生長受到嚴重的抑制，這是由于（NH4）2SO4中的NH+4易變?yōu)镹H3，使藻細胞受到毒害作用。

3.3 磷鹽

磷是微藻正常生長需要的大量營養(yǎng)元素之一，在生命活動中起著至關(guān)重要的作用，光合作用時能量的轉(zhuǎn)化、葉綠體的合成等均不能缺少磷參與。沈盎綠等[17]研究表明，東海原甲藻（ Prorocentrum donghaiense ）和米氏凱倫藻（ Karenia mikimotoi ）在試驗后期較低磷酸鹽水平的情況下仍然能維持較高細胞濃度，說明藻細胞內(nèi)存在明顯的營養(yǎng)鹽庫。該試驗結(jié)果顯示，空白對照組的四爿藻在氮、磷含量很低的情況下（自然海水帶有的少量氮、磷）仍然能維持1周較好的生長（ K 值分別為0.42與0.50），添加氮、磷鹽生長最好的試驗組（ K 值為0.55與0.65），表明四爿藻細胞內(nèi)存在營養(yǎng)鹽庫；KH2PO4和Ca（H2PO4）2均可作為磷源，兩者均以磷含量為2 mg/L為最佳，其中Ca（H2PO4）2效果極顯著優(yōu)于 KH2PO4（ P <0.01）。2種磷源均在P濃度范圍為1～2 mg/L時， K 值隨著P濃度增高逐漸增大，而在P濃度范圍為2～8 mg/L時， K 值隨著質(zhì)量濃度增加逐漸減?。槐砻鞲哔|(zhì)量濃度的磷鹽對四爿藻的生長有抑制作用。

3.4 鐵鹽

鐵是藻類生長發(fā)育必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，在藻類呼吸作用、光合作用、蛋白質(zhì)與核酸合成、固氮作用等生理代謝過程中具有重要的作用[18]。劉彩霞[19]研究指出，小球藻（ Chlorella vulgaris ）在缺鐵培養(yǎng)下小球藻生長速率降低。凌娜等[20]研究表明，蛋白核小球藻（ Chlorella pyrenoidosa ）生長的最適鐵的濃度為1.4 mg/L。該試驗結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4及FeC6H5O均可作為四爿藻的鐵源，鐵元素對其生長有顯著差異（ P <0.05）。最佳的鐵濃度為1 mg/L，鐵質(zhì)量濃度大于1.5 mg/L時，抑制四爿藻的生長。四爿藻兼養(yǎng)培養(yǎng)最佳的鐵鹽FeSO4-Fe為1.00 mg/L。

3.5 維生素B1、B12和VH正交試驗

B族維生素（VB1、VB12、VH）是微藻類生長繁殖必不可少的營養(yǎng)素。孫穎穎等[21]研究表明，在球等鞭金藻添加VB1和VB12時，球等鞭金藻（ Isochrysis galbana ）生長優(yōu)于單獨添加。歐陽葉新等[5]研究表明，在四爿藻培養(yǎng)液加入維生素B12可適當(dāng)增加生長速率。該試驗結(jié)果表明，添加1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12及0.5 mg/L VH可以極顯著增加四爿藻的生長速率（ P <0.01）。

3.6 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證

已有研究表明，微藻兼養(yǎng)的培養(yǎng)效果并非異養(yǎng)與自養(yǎng)的簡單疊加，而是多種因素的綜合性效應(yīng)[11-22]。該研究用優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基與“寧波大學(xué)3#微藻培養(yǎng)基”對比培養(yǎng)四爿藻，結(jié)果表明，培養(yǎng)第7天，兼養(yǎng)培養(yǎng)收獲的細胞密度、干重分別達到3.84×106 cells/mL 及1.14 g/L，分別是“寧波大學(xué)3#培養(yǎng)基”的2.83倍及3.17倍。

4 結(jié)論

四爿藻利用乙酸鈉進行兼養(yǎng)培養(yǎng)可獲得高密度培養(yǎng)。

獲得四爿藻兼養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：6 g/L CH3COONa、50 mg/L NH2CONH2-N、2 mg/L Ca（H2PO4）2-P、1 mg/L FeSO4-Fe、1 mg/L VB1、0.000 5 mg/L VB12和0.5 mg/L VH。

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