戴迪 廖俊 林偉東 馮清 黃攀 梁祥煥 王建 秦愛(ài)建 金文杰

摘要 無(wú)綠藻是一種普遍存在的微藻，屬于綠球藻，可引起人類和動(dòng)物廣泛地感染，其中的左氏無(wú)綠藻與一種嚴(yán)重的牛乳腺炎有關(guān)。該研究采集江蘇部分地區(qū)患乳房炎奶牛奶樣，用綿羊血瓊脂培養(yǎng)、分離，用革蘭氏染色鏡檢及PCR方法確定得到4株左氏無(wú)綠藻（P.zopfii）。這是首次在江蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)奶牛源左氏無(wú)綠藻。

關(guān)鍵詞 奶牛乳房炎 ；左氏無(wú)綠藻； PCR鑒定

中圖分類號(hào) S852.66文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0078-02

Abstract Prototheca is a widespread microalgae，which belongs to Chlorococcum sp.People and animal can commomly infect prototheca.Among of them ， Prototheca zopfii was related to severe mastitis of cow.Milk samples of cow having mastitis were collected from part of Jiangsu.4 P. zopfii were identified by gram stain microscopy and PCR method using sheep blood agar to cultur and isolate them. P. zopfii sourced from cowed was first discovered in Jiangsu area.

Key words Cow mastitis； Prototheca zopfii； PCR identification

無(wú)綠藻是一種和綠藻相近的無(wú)葉綠素藻類，是自然界一種常見(jiàn)條件致病真菌，可廣泛存在于污水、土壤、植物及動(dòng)物中；無(wú)綠藻病可引起人與動(dòng)物的感染。在牛的無(wú)綠藻感染癥中，其多表現(xiàn)為頑固性乳房炎，因無(wú)綠藻的菌落形態(tài)與酵母樣真菌類似，故而在臨床診斷中容易發(fā)生誤診。

從1894年Kruger發(fā)現(xiàn)無(wú)綠藻后，陸續(xù)確認(rèn)了6種無(wú)綠藻： Prototheca moriformis（1894）、Prototheca stagnora（1985）、Prototheca ulemea（1986）、Prototheca wickerhamii（1959）、Prototheca zopfii（1894）、Prototheca blaschkeae（2006）。

在1952年，左氏無(wú)綠藻首次被確定為奶牛乳房炎的致病菌[1-3]，能引起奶牛產(chǎn)奶量急劇下降，乳房輕度腫脹，乳汁呈水樣，伴有絮狀沉淀，且對(duì)抗生素治療效果不佳[4-6]，容易成為感染源，故最好的控制方法就是淘汰患病牛只。左氏無(wú)綠藻感染奶牛后易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)食品公共安全存在潛在的威脅。

無(wú)綠藻引起的乳房炎在德國(guó)、美國(guó)、意大利、葡萄牙、英國(guó)、日本和西班牙等國(guó)家被廣泛報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)的報(bào)道，因而對(duì)無(wú)綠藻性臨床型乳房炎的診斷及其危害評(píng)估和防控具有很大的必要性和迫切性[7]。

1 材料與方法

1.1 試劑

新鮮脫脂綿羊鮮血（杭州微生物有限公司），瓊脂粉，革蘭染色液（廣州蕊特科技有限公司），PCR Mast mix（Dye plus） （諾唯贊生物科技有限公司）；試劑盒：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（GenScript）。

1.2 培養(yǎng)基

綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，配制方法

參考文獻(xiàn)[8]，改良馬丁培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 左氏無(wú)綠藻的分離。從江蘇部分養(yǎng)殖場(chǎng)患乳房炎的奶牛采集好奶樣，4 ℃保存。分離奶樣中細(xì)菌時(shí)，先將采樣管中奶樣搖勻，在無(wú)菌條件下，取出100 μL奶樣，均勻涂布到60 mm規(guī)格的血瓊脂平板上，在超凈臺(tái)內(nèi)晾干后，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，然后觀察菌落，根據(jù)其顏色、形態(tài)、溶血性、數(shù)目（菌落數(shù)目小于3的舍棄），分別挑取可疑單菌落劃線接種于綿羊血鮮血培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h。挑取單菌落分別進(jìn)行革蘭染色并在1 000倍光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 PCR鑒定左氏無(wú)綠藻。

特異性PCR分析4個(gè)左氏無(wú)綠藻分離株的18S rRNA。酵母樣細(xì)胞在改良馬丁固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h后用于基因提純。使用GenScript細(xì)菌DNA提純?cè)噭┖刑崛』蚪MDNA，溶解在50 μL的超純水中。

左氏無(wú)綠藻的鑒定采用PCR方法，參考文獻(xiàn)[9]選用引物Proto18-4f（5′-GACATGGCGAGGATTGACAGA-3′）和Proto18-4r（5′-AGCACACCCAATCGGTAGGA-3′）進(jìn)行鑒定，目的條帶大小450 bp。

20 μL PCR擴(kuò)增體系如下：1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL DNA模板，7 μL ddH2O，10 μL 2× Taq Master Mix（Dye Plus）；5 min 95 ℃ 32個(gè)循環(huán)，模板變性（1 min 95 ℃），引物退火（1 min 57 ℃），聚合（45 s 72 ℃），10 min 72 ℃，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂進(jìn)行電泳（80 V，80 min），用Gelsafe進(jìn)行顯色。

對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 左氏無(wú)綠藻革蘭氏染色結(jié)果 單菌落經(jīng)革蘭氏染色可見(jiàn)大的球形細(xì)胞、中央?yún)^(qū)著深紫色、邊緣紅染[10]。

2.2 不同培養(yǎng)基純化培養(yǎng)

2.2.1 綿羊血瓊脂生長(zhǎng)情況。4個(gè)分離株在37 ℃、48 h綿羊血瓊脂培養(yǎng)結(jié)果（圖2），在血平板上生長(zhǎng)較緩慢為點(diǎn)狀白色圓形。