楊光 羅建平 王瑛

摘要 [目的]研究外源多胺促進霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生與過氧化氫（H2O2）代謝酶活性的關(guān)系。[方法]主要測定了外源多胺處理后H2O2的動態(tài)變化和代謝酶的活性。[結(jié)果]外源多胺在有效促進芽發(fā)生的同時也能顯著提高培養(yǎng)物中H2O2的含量，2.0 mmol/L亞精胺（Spd）或腐胺（Put）處理5 d的培養(yǎng)物中H2O2含量分別比對照組高175.6%和180.6%，添加H2O2淬滅劑二甲基硫脲（DMTU）可抑制類原球莖芽的發(fā)生，補充Spd或Put可部分解除DMTU的抑制作用。在外源多胺處理前期和中期，雖然超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性無明顯改變，但合成H2O2的多胺氧化酶（PAO）活性和分解H2O2的抗壞血酸過氧化物酶（APX）與過氧化氫酶（CAT）活性明顯增加。[結(jié)論]外源多胺作用的霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生與H2O2積累和分解代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞 霍山石斛；外源多胺；類原球莖；芽發(fā)生；代謝酶

中圖分類號 S567.2文獻標識碼

A文章編號 0517-6611（2018）01-0001-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the relationship between enhanced conversion of protocorm-like bodies （PLBs） of Dendrobium huoshanense to shoots by exogenous polyamines （PAs） and H2O2-metabolizing enzyme activities.[Method]We mainly measured the dynamic changes of H2O2 and the activities of metabolizing enzyme after exogenous polyamines treatment.[Result]Exogenous addition of PAs not only promoted the conversion frequency of PLBs to shoots but also elevated the levels of H2O2，compared with the control， the H2O2 levels in PAs groups increased by 175.6% （Spd） and 180.6% （Put） on the 5th day after being treated using 2.0 mmol/L Spd or Put for 5 days.Dimethylthiourea （DMTU）， the scavenger of H2O2， inhibited conversion of PLBs to shoots and the effect could be offset partly by exogenous PAs.Although the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） did not change significantly in the early and middle stages of exogenous polyamine treatment，the activity of polyamine oxidase （PAO） for synthesizing H2O2，ascorbate peroxidase （APX） for dissolving H2O2 and catalase （CAT） were significantly increased. [Conclusion]The occurrence of protocorm buds of Dendrobium huoshanense with the action of exogenous polyamines is related to the accumulation and catabolism of H2O2.

Key words Dendrobium huoshanense； Exogenous polyamines；Protocorm-like bodies；Shoot morphogenesis；Metabolizing enzymes

多胺是生物體內(nèi)廣泛存在的一類具有生物活性的物質(zhì)，它作為信號分子參與了植物胚胎形成、根和芽發(fā)生、花發(fā)育、果實成熟及衰老等生長發(fā)育過程，對植物的形態(tài)發(fā)生具有促進作用[1]。過氧化氫（H2O2）被認為是植物體內(nèi)產(chǎn)生的最穩(wěn)定的活性氧分子，現(xiàn)有研究認為它的積累與分解誘發(fā)了調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，是影響植物生長發(fā)育的一種重要的胞內(nèi)分子[2]。鑒于多胺可以通過多胺氧化酶（PAO）生成H2O2導致胞內(nèi)H2O2積累并觸發(fā)相關(guān)代謝酶分解H2O2[3-4]，推測多胺促進的植物形態(tài)發(fā)生可能與多胺代謝過程中H2O2的積累和分解相關(guān)。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.J.cheng）是特產(chǎn)于安徽霍山的名貴瀕危中藥材，屬蘭科石斛屬，具有滋陰、清熱、生津、潤肺、止咳、明目等功效[5-6]?；羯绞F(xiàn)已成功人工栽培，其種苗均是來自種子經(jīng)類原球莖形態(tài)發(fā)生所形成的試管苗。筆者將從芽發(fā)生過程中H2O2代謝變化的角度探討多胺促進霍山石斛類原球莖芽高效發(fā)生的生理生化機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 霍山石斛類原球莖由合肥工業(yè)大學中草藥與功能食品研究所提供，傳代培養(yǎng)基為添加0.5 mg/mL NAA和0.5 mg/mL KT的固體MS培養(yǎng)基[7]。類原球莖（PLBs）每35 d傳代培養(yǎng)1次。取類原球莖轉(zhuǎn)接于無外源激素的固體MS培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度（25±2）℃、光照時間16 h/d、相對濕度80%、光照強度30 μmol/（m2·s）條件下預培養(yǎng)30 d作為試驗材料。

1.2 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的影響 將經(jīng)預培養(yǎng)的類原球莖分別接種于添加2.0 mmol/L亞精胺（Spd）、2.0 mmol/L腐胺（Put），以及5.0 mmol/L過氧化氫淬滅劑二甲基硫脲（DMTU）和Spd（2.0 mmol/L）或Put（2.0 mmol/L）組合的無植物激素固體MS培養(yǎng)基上為處理組，以不添加多胺和DMTU為對照，在培養(yǎng)溫度（25±2）℃、相對濕度80%、光照時間16 h/d、光照強度50 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)30和60 d時觀察并統(tǒng)計芽的發(fā)生情況。芽發(fā)生頻率以1 g類原球莖中產(chǎn)生的芽的個數(shù)表示。

1.3 H2O2含量的測定

根據(jù)Jincya等[8]的方法，通過監(jiān)測過氧化物-Ti復合物在410 nm的吸光度測定培養(yǎng)物中H2O2水平，再根據(jù)標準曲線計算H2O2的濃度。

1.4 H2O2代謝相關(guān)酶活性的測定

多胺氧化酶（PAO）活性的測定參照汪耀富等[9]方法進行檢測；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Gupta等[10]和魯萍等[11]的方法，測定SOD在光下抑制氮藍四唑（NBT）的還原作用，以抑制NBT光化學還原50%為1個酶活單位；過氧化氫酶（CAT）活性測定參照Ayvaz等[12]的方法，在反應(yīng)體系中加入50 mmol/L pH 7.0 的磷酸緩沖液、0.1 mL 3%過氧化氫和適量酶液啟動反應(yīng)，當反應(yīng)開始后迅速測定波長240 nm處吸光度的下降速率，以1 min 1 mg蛋白分解1 μmol H2O2 為1個酶活力單位；過氧化物酶（POD）活性的測定參照Saidi等[13]的方法，用酶液啟動反應(yīng)并以0.25%愈創(chuàng)木酚和0.75%過氧化氫為底物，測定470 nm處吸光度的上升速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚為1個酶活單位；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Saidi等[13]的方法，稱取0.5 g冰凍材料，研磨后于冰上加入5 mL提取緩沖液混勻提取，提取液4 ℃下離心取上清液，在25 ℃下直接測定波長290 nm處由于抗壞血酸氧化而引起吸光度的下降速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 抗壞血酸為1個酶活單位。所有提取液的可溶性蛋白質(zhì)含量按Mollavali等[14]方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 試驗中所有處理均為隨機處理，且做5～10個平行并重復3次。數(shù)據(jù)采用均值± SE表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件計算其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的影響

從表1可以看出，在培養(yǎng)30 d時，添加2.0 mmol/L Spd或Put的MS培養(yǎng)基中，霍山石斛類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是對照組的3.7 倍（Spd）和3.6倍（Put）；培養(yǎng)60 d時，多胺組芽發(fā)生總數(shù)分別是對照組的3.4 倍（Spd）和3.2 倍（Put），且多胺組大于5 mm的芽在30 d時分別占各自芽總數(shù)的23.3%和26.9%、在60 d時分別占各自芽總數(shù)的13.4%和16.3%，而對照組在30 d時無大于5 mm的芽、在60 d時占芽總數(shù)的18.0%，說明外源Spd或Put不僅能顯著促進霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生，在早期也能有效促進新生芽的生長。

進一步通過加入過氧化氫淬滅劑DMTU對外源多胺作用下H2O2水平與霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的相關(guān)性進行了探討，結(jié)果表明，當類原球莖在僅加入DMTU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)顯著降低，為對照組的44.7%，培養(yǎng)60 d時芽發(fā)生總數(shù)為對照組的35.8%，DMTU抑制芽發(fā)生的作用更為明顯（表1、2）；當類原球莖在同時加入多胺和DMTU的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，多胺促進的芽發(fā)生效應(yīng)被顯著抑制，培養(yǎng)30 d時每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是僅添加Spd和Put的24.6%和22.8%且無大于5mm的芽，在培養(yǎng)60 d時每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是僅添加Spd和Put的28.4%和24.5%，說明類原球莖培養(yǎng)早期H2O2含量的升高為芽發(fā)生所必須，H2O2參與了多胺促進的霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生。

2.2 外源多胺促進霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2含量的動態(tài)變化

為探求H2O2 與霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生是否存在關(guān)聯(lián)性，試驗測定了外源多胺作用對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程H2O2水平的影響。從圖1 可以看出，無多胺存在的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物中H2O2 的含量從培養(yǎng)開始急劇上升，在第5天時達到高峰隨后下降，并保持在一個較低的水平；在多胺組中，培養(yǎng)第5天的培養(yǎng)物中H2O2含量可高達對照組的175.6%（Spd）和180.6%（Put），并在培養(yǎng)第40天后與對照組H2O2含量接近，說明外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生早期H2O2積累的誘導作用明顯，提示多胺促進的霍山石斛類原球莖芽發(fā)生與H2O2水平存在關(guān)聯(lián)。

2.3 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2代謝酶活性的影響

2.3.1 PAO 活性。

PAO能催化多胺氧化降解產(chǎn)生H2O2，通過分析外源多胺作用下類原球莖芽發(fā)生過程中引起的PAO 活性變化，可揭示PAO 活性變化、H2O2的產(chǎn)生與芽發(fā)生三者之間的相互關(guān)系。從圖2可看出，霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中，對照組和多胺組中PAO 活性變化趨勢相一致，在初期急劇上升，在第5天出現(xiàn)高峰，隨后迅速下降后趨于平緩。添加外源多胺能顯著提高PAO的活性，并一直維持在較高水平，多胺組在培養(yǎng)第5天時PAO活性分別是對照組的21.2%（Spd）和14.9%（Put），說明外源多胺明顯地促進了PAO活性。PAO的活性變化與芽發(fā)生過程中H2O2積累的變化（圖1）相一致，揭示霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2的積累可能與外源多胺誘導的PAO活性變化有關(guān)。

2.3.2 SOD 活性。

SOD 是植物細胞中重要的清除自由基的酶類之一，其主要作用是催化

O2·-生成H2O2，并清除細胞中多余的超氧陰離子。從圖3可看出，對照組和多胺組SOD活性變化情況基本一致，SOD 活性在培養(yǎng)前期急劇下降，最后趨于平緩，說明外源多胺對SOD 的活性影響較小，SOD對于類原球莖芽發(fā)生早期H2O2的積累無明顯作用。

2.3.3 CAT 活性。

CAT作為清除H2O2的主要酶類，能將H2O2分解為H2O和O2。由圖4 可見，多胺組中CAT活性變化是從培養(yǎng)初期開始緩慢上升，第20天達到最高后迅速下降，而對照組相對比較平緩。在整個培養(yǎng)過程中，多胺組CAT活性始終高于對照組，CAT活性在培養(yǎng)第20天的Put組和Spd組中分別是對照的1.2和1.3倍，表明外源多胺可顯著提高霍山石斛類原球莖抗氧化酶CAT的催化作用，說明外源多胺在早期（5 d）通過PAO升高H2O2的含量，隨后由CAT分解。

2.3.4 POD 活性。

POD是逆境條件下植物酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一， 它與SOD、CAT合作將過剩的自由基去除，使體內(nèi)保持正常的自由基水平。由圖5 可見，外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中POD的活性影響較小，說明類原球莖芽發(fā)生早期積累的H2O2不是由POD所降解。

2.3.5 APX 活性。APX是植物細胞中的H2O2清除酶，由圖6可見，外源添加多胺明顯提高APX的活性，在培養(yǎng)的第5天多胺組中APX活性約為對照組的13%，同時對照組和多胺組中APX活性變化趨勢一致，與圖1 相比，APX的活性變化與芽發(fā)生過程中H2O2 的積累趨勢一致，說明APX在類原球莖芽發(fā)生早期（5 d）能快速分解大量生成的H2O2。

3 討論與結(jié)論

研究表明，多胺調(diào)節(jié)植物生長的機制取決于多胺的合成和氧化的同時還取決于其氧化代謝過程[15-16]。 PAO是涉及多胺氧化代謝的關(guān)鍵酶之一，催化Spd和精胺（Spm）的次級氨基氧化產(chǎn)生吡咯啉、1-（3-丙氨基）吡咯啉、二氨基丙烷和H2O2 [17]。由于H2O2是PAO催化多胺氧化降解的主要產(chǎn)物之一，PAO活性提高，表明它有利于H2O2的積累[18]。該試驗結(jié)果表明，在外源多胺作用下，不僅霍山石斛類原球莖芽發(fā)生率顯著提高，而且2.0 mmol/L Spd或Put處理5 d的培養(yǎng)物中H2O2含量分別比對照組高175.6%和180.6%，芽發(fā)生初期PAO活性和H2O2積累也同步上升，說明多胺促進的芽發(fā)生與PAO活性升高促使H2O2積累有關(guān)，H2O2淬滅劑DMTU抑制H2O2積累和芽發(fā)生的試驗結(jié)果進一步證明了H2O2積累在多胺促進霍山石斛類原球莖芽發(fā)生中的作用。

H2O2作為植物細胞中各種應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的重要信號分子，已被證明參與植物激素的信號級聯(lián)及激素調(diào)控植物生長發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導[19-20]。然而，細胞中H2O2的過量對植物有毒性，但是它可以被CAT和APX分解[21]。 CAT和APX對H2O2親和力和結(jié)合機制是不同的，CAT可以直接分解H2O2，但與H2O2的親合力相對較弱；APX需要抗壞血酸作為底物，對H2O2具有很強的親和力。該研究在外源多胺處理前期和中期，SOD和POD活性無明顯改變，而合成H2O2的PAO活性和分解H2O2的APX與CAT活性明顯增加，說明霍山石斛類原球莖在芽發(fā)生早期（5 d）由于外源多胺促進了H2O2的產(chǎn)生，引起細胞內(nèi)H2O2的含量急速上升，為了使細胞免于毒害，APX活性急劇上升后迅速下降，而CAT活性在培養(yǎng)中期（20 d）時達到最高，說明APX和CAT分別在霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的初期和中期對細胞進行解毒。在清除H2O2 毒性過程中，細胞體內(nèi)氧化還原狀態(tài)和與它們氧化還原反應(yīng)相關(guān)的一些酶類活性水平的變化誘發(fā)了某些調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因表達的改變[2，22-23]，從而促進了霍山石斛類原球莖的芽發(fā)生。

綜上分析，外源多胺促進霍山石斛類原球莖芽發(fā)生與細胞內(nèi)活性氧信號可能有關(guān)，外源多胺作用下PAO活性的升高導致了大量H2O2的產(chǎn)生，積累的H2O2由同步升高的APX和隨后升高的CAT分解，在H2O2積累和分解過程中，細胞內(nèi)的相關(guān)氧化代謝酶發(fā)生改變，可能參與了多胺促進芽發(fā)生的信號介導。

參考文獻

[1] TIBURCIO A F，ALTABELLA T，BITRIN M，et al.The roles of polyamines during the lifespan of plants： From development to stress[J].Planta，2014，240（1）： 1-18.

[2] NEILL S，DESIKAN R，HANCOCK J.Hydrogen peroxide signalling[J].Curr Opin Plant Biol，2002，5（5）： 388-395.

[3] POTTOSIN I，VELARDE-BUEND A A M，BOSE J，et al.Cross-talk between reactive oxygen species and polyamines in regulation of ion transport across the plasma membrane：Implications for plant adaptive responses[J].J Exp Bot，2014，65（5）： 1271-1283.

[4] GUPTA B，HUANG B R.Mechanism of salinity tolerance in plants： Physiological， biochemical， and molecular characterization[J].Int J Genomics，2014，2014：1-18.

[5] 包雪聲，順慶生，陳立鉆.中國藥用石斛[M].上海： 復旦大學出版社，2001： 1-75.

[6] 王博，潘利華，羅建平，等.水楊酸對霍山石斛類原球莖細胞生長及多糖合成的影響[J]. 生物工程學報，2009，25（7）： 1062-1068.

[7] WANG Y，LUO J P，WU H Q，et al.Conversion of protocorm-like bodies of Dendrobium huoshanense to shoots：The role of polyamines in relation to the ratio of total cytokinins and indole-3-acetic acidindole-3-acetic acid[J].J Plant Physiol，2009，166（18）： 2013-2022.

[8] JINCYA M，DJANAGUIRAMAN M，JEYAKUMAR P，et al.Inhibition of phospholipase D enzyme activity through hexanal leads to delayed mango （Mangifera indica L.） fruit ripening through changes in oxidants and antioxidant enzymes activity[J].Scientia horticulturae，2017，218： 316-325.

[9] 汪耀富，張瑞霞.滲透脅迫下烤煙內(nèi)源多胺含量及其代謝酶活性變化[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2005，23（6）： 88-92，97.

[10] GUPTA D K，PENA L B，ROMERO-PUERTAS M C，et al.NADPH oxidases differentially regulate ROS metabolism and nutrient uptake under cadmium toxicity[J].Plant，cell & environment，2017，40（4）： 509-526.

[11] 魯萍，桑衛(wèi)國，馬克平.外來入侵種飛機草在不同環(huán)境脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的變化[J]. 生態(tài)學報，2006，26（11）： 3578-3585.

[12] AYVAZ M，GUVEN A，BLOKHINA O，et al.Boron stress， oxidative damage and antioxidant protection in potato cultivars （ Solanum tuberosum L.） [J].Acta Agric Scand，2016，66（4）： 302-316.

[13] SAIDI I，CHTOUROU Y，DJEBALI W.Selenium alleviates cadmium toxicity by preventing oxidative stress in sunflower （Helianthus annuus） seedlings[J].J Plant Physiol，2014，171（5）：85-91.

[14] MOLLAVALI M，BOLANDNAZAR S A，SCHWARZ D，et al.Flavonol glucoside and antioxidant enzyme biosynthesis affected by mycorrhizal fungi in various cultivars of onion （ Allium cepa L.） [J]. J Agric Food Chem， 2016， 64（1）： 71-77.

[15] TAVLADORAKI P，CONA A，ANGELINI R.Copper-containing amine oxidases and FAD-dependent polyamine oxidases are key players in plant tissue differentiation and organ development[J].Front Plant Sci，2016，7： 824.

[16] 王瑛.多胺促進霍山石斛類原球莖芽發(fā)生及作用機理的研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學， 2009.

[17] 黃亞成，秦云霞.植物中活性氧的研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2012，28（36）：219-226.

[18] NIU L J，LIAO W B.Hydrogen peroxide signaling in plant development and abiotic responses： Crosstalk with nitric oxide and calcium[J].Front Plant Sci，2016，7： 230.

[19] NATH M，BHATT D，PRASAD R，et al.Reactive oxygen species （ROS） metabolism and signaling in plant-mycorrhizal association under biotic and abiotic stress conditions[M]//VARMA A，PRASAD R，TUTEJA N.Mycorrhiza-Eco-Physiology，Secondary Metabolites，Nanomaterial.Cham，Switzerland：Springer，2017： 223-232.

[20] 謝彥杰.血紅素加氧酶/一氧化碳信號系統(tǒng)介導擬南芥和小麥對鹽、滲透和 UV-C 脅迫適應(yīng)性的分子機理[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011.

[21] OZDEN M，DEMIREL U，KAHRAMAN A.Effects of proline on antioxidant system in leaves of grapevine （ Vitis vinifera L.） exposed to oxidative stress by H2O2[J].Scientia horticulturae，2009，119（2）：163-168.

[22] 王瑞剛.鹽誘導氧化脅迫與楊樹耐鹽性研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2007.

[23] 李麗思.鹽誘導胡楊細胞抗氧化防御的信號調(diào)控機制[D].北京：北京林業(yè)大學，2010.