潘飛龍 高婭北 王松峰 宋朝鵬 孫曙光 楊曉亮 申洪濤

摘 要：為了探究不同品種烤煙成熟期糖代謝的變化規(guī)律，明確煙葉品質(zhì)形成的分子作用機理。以烤煙品種秦?zé)?6、豫煙6號和K326為試驗材料，測定分析了烤煙成熟期水溶性糖組分（葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、還原糖和可溶性總糖）含量、糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達的變化。結(jié)果表明，3個品種烤煙水溶性糖組份含量變化趨勢基本一致，各水溶性糖（蔗糖除外）含量呈先升高后降低的變化趨勢，煙葉成熟時其含量達到峰值；蔗糖含量呈雙峰波動，煙葉成熟時蔗糖含量較低。煙葉打頂至適熟階段，SPS和AI酶活性對煙葉中水溶性糖的積累貢獻最大，NtINV對煙葉糖代謝起主要調(diào)控作用；當煙葉由適熟至過熟時，AI酶活性主要參與煙葉糖代謝活動，而SS和SPS則對蔗糖積累起重要作用，NtSS和NtSPS對煙葉糖代謝起主要調(diào)控作用。同一生態(tài)環(huán)境和栽培條件下，豫煙6號內(nèi)含物質(zhì)充實，具有較高的水溶性糖分含量，SPS和AI酶活性的差異可能是造成煙葉糖組分及含量不同的重要原因。

關(guān)鍵詞：烤煙；成熟期；糖代謝；酶活性；基因表達

中圖分類號：S572.01 文章編號：1007-5119（2018）05-0047-10 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.007

Abstract： In order to explore the changes of sugar metabolism in different varieties of flue-cured tobacco， clarifying the molecular mechanism of the formation of tobacco leaf quality， the flue-cured tobacco varieties Qinyan 96， Yuyan 6 and K326 were taken as the sample materials to determine the changes of water-soluble sugar components （glucose， fructose， maltose， sucrose， reducing sugars， and total soluble sugars）， key enzyme activities in sugar metabolic and gene expression changes at mature stage. The results showed that the trend of change in water soluble sugar content in the three varieties of flue-cured tobacco was basically the same. The contents of water soluble sugars （except sucrose） first increased and then decreased， reaching the peak when tobacco leaves matured. The sucrose content showed a bimodal fluctuation， and the sucrose content was the lowest when the tobacco was mature. The activity of SPS and AI enzymes contributed the most to the accumulation of water-soluble sugars in tobacco leaves from topping to proper maturity. NtINV played a major role in regulating sugar metabolism in tobacco leaves. When tobacco leaves were from ripe to overripe status， AI enzyme activity was mainly involved in tobacco sugar metabolism， while SS and SPS played an important role in sucrose accumulation. NtSS and NtSPS played a major role in regulating sugar metabolism. Under the same ecological environment and cultivation conditions， the content of metabolites in Yuyan 6 was enriched and had high water-soluble sugar content. The difference of SPS and AI enzyme activity may be an important reason for the different sugar components and content of tobacco leaves.

Keywords： flue-cured tobacco； mature stage； sugar metabolism； enzyme activity； gene expression

糖代謝是烤煙植株生命活動最基本的初生代謝之一[1]，對煙葉的生長發(fā)育、干物質(zhì)積累有重要影響[2]?？緹煶墒炱谔谴x的平衡與協(xié)調(diào)，最終影響煙葉品質(zhì)。此外，還原糖也是影響煙葉品質(zhì)的重要化學(xué)成分，可調(diào)節(jié)煙氣酸堿平衡，增加煙葉香吃味[3]。因此，研究烤煙成熟期水溶性糖含量動態(tài)變化規(guī)律、糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達模式對探究煙葉品質(zhì)形成的機理有重要意義。

煙葉內(nèi)可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖。蔗糖是煙葉內(nèi)光合作用的主要產(chǎn)物，在碳同化物積累、運輸和貯藏中發(fā)揮重要作用[4]。蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）是蔗糖代謝關(guān)鍵酶，其活性對植物糖代謝有重要影響[5-6]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性可作為碳代謝的標志[7]，其不可逆地催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，參與韌皮部的卸載與庫的建立，同時也與煙葉生長和器官建成有關(guān)[8-9]。蔗糖磷酸合成酶控制植物體內(nèi)碳素的分配和流向，其活性與蔗糖積累趨勢相似，在糖代謝中起關(guān)鍵作用[10]。前人通過對大豆、小麥、水稻等作物研究發(fā)現(xiàn)，葉片糖代謝與相關(guān)酶或基因之間密切相關(guān)[11-13]。就煙葉糖代謝研究而言，王紅麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝相關(guān)基因如蔗糖合成酶基因（NtSS）、蔗糖磷酸合成酶基因（NtSPS），轉(zhuǎn)化酶基因（NtINV）隨著煙草生育期的進行逐漸增強。牛德新等[15]研究發(fā)現(xiàn)，烤煙移栽后90 d，高氮處理顯著增強INV的表達量。史宏志等[16]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉發(fā)育的不同階段各酶活性不同，轉(zhuǎn)化酶活性先升高后降低，旺長期時轉(zhuǎn)化酶活性達到峰值。賈宏昉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，植煙土壤中增施腐熟秸稈可增強蔗糖代謝相關(guān)基因NtSuS等的表達，促進成熟期煙葉的碳代謝，進而提高煙葉品質(zhì)。

目前對煙葉糖代謝的研究集中在相關(guān)酶活性或者相關(guān)基因等單方面因素，對于烤煙成熟期糖代謝物質(zhì)變化、關(guān)鍵酶活性及基因表達模式系統(tǒng)性的研究鮮有報道。本研究以秦?zé)?6、豫煙6號和K326為材料，測定煙葉成熟期水溶性糖含量及糖代謝關(guān)鍵酶活性變化，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)測定關(guān)鍵酶基因的表達規(guī)律，旨在系統(tǒng)探究煙葉品質(zhì)形成的分子作用機理，為優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年在河南省洛陽市洛寧縣小界衛(wèi)洼煙葉標準化生產(chǎn)示范田（東經(jīng)111°38′，北緯34°26′）進行，選用當?shù)刂髟钥緹熎贩N秦?zé)?6、豫煙6號和K326為試驗材料。煙苗于2017年5月8日移栽，單株有效葉數(shù)18～20片，以培育“中棵煙”目標要求進行田間管理。試驗土壤為黃棕壤，土壤基本理化性質(zhì)：pH 7.26，有機質(zhì)13.52 g/kg，堿解氮75.18 mg/kg，速效磷9.17 mg/kg，速效鉀164.37 mg/kg。試驗田內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)標準，實施漂浮育苗、平衡施肥、地膜覆蓋、清棵培土、化學(xué)抑芽等技術(shù)措施，采用機械化作業(yè)，水肥一體化灌溉技術(shù)，其中水肥一體化采用煙葉水肥一體化自動注灌設(shè)備（貴州瑞欣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司）。煙田施氮量為72 kg/hm2，施用肥料為煙草專用復(fù)合肥[云南云葉化肥股份有限公司，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1∶2]。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個品種設(shè)置6個取樣時期，重復(fù)3次，共54個小區(qū)，小區(qū)面積16.5 m2，行株距1.1 m×0.5 m，每個試驗小區(qū)植煙30株。取樣時選取不同小區(qū)內(nèi)長勢均勻一致的煙株，每個品種各6株，試驗部位為中部葉（10～12葉位），煙葉打頂當天即移栽后65 d開始取樣，隨后每10天取樣一次，共取樣6次。每次取樣煙葉大小均勻一致，去除主脈，選取第6至第7支脈葉肉組織，混合樣品，每份樣品約5 g，置于液氮中速凍，然后于-80 ℃冰箱中保存，用于酶活性和基因表達量分析；另一部分煙葉先于105 ℃下殺青20 min， 再65 ℃烘干，研磨，過60目篩保存，用于化學(xué)成分測定。每個時期進行3次重復(fù)。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 可溶性糖含量測定 煙葉可溶性糖的提取采用牛景等[18]方法，葡萄糖、果糖和蔗糖的含量測定采用高效液相色譜法[19]（Waters1525 HPLC，USA）測定，色譜條件：Carbohydrate Analysis 84038色譜柱，柱溫82 ℃，流速0.5 mL/min，流動相為重蒸水，常溫示差折光檢測器，Waters Breeze TM軟件控制HPLC運行和進行數(shù)據(jù)采集分析。煙葉總糖和還原糖采用AA3型連續(xù)流動化學(xué)分析儀（德國BRAN + LUEBBE公司生產(chǎn)）測定，參照行業(yè)標準YC/T159—2002方法。

1.3.2 糖代謝關(guān)鍵酶活性測定 蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）（分解方向）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）、酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）活性分別按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)酶試劑盒說明書方法進行測定。

1.3.3 糖代謝相關(guān)基因表達量分析 采用改良CTAB法[20]提取樣品內(nèi)總RNA，通過隨機引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA[21]。從GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中檢索煙草蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）序列，利用Roche LCPDS2設(shè)計引物，引物列表見表1。其中煙草核糖體蛋白基因L25[22]作為內(nèi)參基因。使用HiScript? II qRT SuperMix II試劑配制反應(yīng)體系于PCR儀（ABI9700）中合成第一鏈cDNA。按照Invitrogen公司的Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒操作指導(dǎo)，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法檢測基因的相對表達量。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)熱5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次。每個樣品均設(shè)置3次重復(fù)。采用2–ΔΔCt算法[23]對試驗結(jié)果進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進行整理，用Origin 9.1進行作圖，用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同品種烤煙成熟期水溶性糖組份含量變化

如圖1a所示，3個品種烤煙成熟期葡萄糖含量變化趨勢一致，先升高后降低；秦?zé)?6、豫煙6號和K326煙葉葡萄糖含量均于移栽后95 d最高，分別達到21.4、22.3和20.9 mg/g；煙葉成熟后（移栽后95 d）葡萄糖含量逐漸降低。如圖1b所示，秦?zé)?6果糖含量在成熟期含量高于豫煙6號和K326，煙葉移栽后85 d之前果糖積累速率較快，移栽后95 d其含量快速降低，煙葉成熟時豫煙6號和K326果糖含量差異不顯著。與葡萄糖和果糖含量相比，煙葉內(nèi)麥芽糖含量較低（圖1c），3個品種烤煙成熟期麥芽糖含量變化趨勢一致，呈單峰波動，煙葉成熟時麥芽糖含量達到最高，不同品種烤煙麥芽糖含量差異不顯著。如圖1d所示，煙葉成熟期蔗糖含量呈雙峰變化趨勢，移栽后95 d，蔗糖含量最低，隨著生育期的進行，蔗糖含量稍有增加隨后又逐漸減少；豫煙6號在成熟期具有較高的蔗糖含量。煙葉成熟期還原糖含量與葡萄糖、果糖和麥芽糖含量變化趨勢相似，如圖1e所示，煙葉還原糖含量隨著煙葉的成熟先升高后降低，移栽后95 d時，還原糖含量達到峰值，此時豫煙6號還原糖含量最高（44.2 mg/g），其次為K326（43.1 mg/g）和秦?zé)?6（41.5 mg/g）。3個品種烤煙可溶性總糖含量在移栽后85 d達到最大（圖1f），隨后其含量呈不同程度下降；成熟期豫煙6號可溶性總糖含量均顯著高于秦?zé)?6和K326。

2.2 不同品種烤煙成熟期糖代謝關(guān)鍵酶活性變化

如圖2a所示，在秦?zé)?6、豫煙6號和K326煙葉中，SS活性（分解方向）具有相同的動態(tài)變化趨勢，成熟期呈先上升后下降再上升的變化趨勢；秦?zé)?6和K326煙葉SS活性在移栽后85 d最高，分別為2.710和2.421 mg/（g·min），而豫煙6號SS活性在移栽后95 d達到最高，為2.692 mg/（g·min），之后活性逐漸下降，至移栽后105 d，SS活性又快速升高。

不同品種烤煙SPS酶活性在成熟期呈先上升后波動降低的變化趨勢（圖2b），移栽后75 d，SPS活性最高；秦?zé)?6和K326煙葉SPS活在煙葉成熟時（移栽后95 d）最低，分別為0.314和0.301 mg/（g·min），隨后SPS活性略有回升，而豫煙6號SPS活性在煙葉成熟時則顯著高于秦?zé)?6和K326，為0.361 mg/（g·min）。移栽后115 d，3個品種烤煙SPS活性差異不顯著。

秦?zé)?6和豫煙6號煙葉AI活性變化趨勢相同（圖2c），呈單峰波動趨勢，移栽后85 d，煙葉AI活性最高；K326煙葉AI活性與秦?zé)?6和豫煙6號AI活性變化趨勢相似，但其AI活性峰值在移栽后95 d；煙葉成熟時（移栽后95 d），3個品種烤煙AI活性存在顯著差異。與AI活性相比，在整個煙葉成熟階段，葉片內(nèi)NI活性始終顯著低于AI酶活性（圖2d），煙葉內(nèi)NI活性較低、變化幅度較小；隨著煙葉的成熟，葉片內(nèi)NI活性略有下降；移栽后95 d之前，豫煙6號NI活性略高于秦?zé)?6和K326，之后其NI活性差異不顯著。

2.3 不同品種烤煙成熟期糖代謝相關(guān)基因表達量分析

如圖3所示，通過對不同品種烤煙成熟期煙葉糖代謝相關(guān)基因（NtSS、NtSPS、NtINV）表達量的分析發(fā)現(xiàn)，在煙葉整個成熟階段中，NtSS的表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，移栽后85 d葉片內(nèi)NtSS表達量達到第一個峰值，此時豫煙6號NtSS表達量最高；煙葉成熟時（移栽后95 d），K326葉片內(nèi)NtSS表達量顯著高于秦?zé)?6和豫煙6號。蔗糖磷酸合成酶基因NtSPS表達量研究表明，移栽后105 d之前，各品種烤煙葉片內(nèi)NtSPS表達量的上調(diào)與下調(diào)變化規(guī)律不明顯，但移栽后115 d葉片內(nèi)NtSPS的表達量顯著上調(diào)。不同品種烤煙葉片內(nèi)NtINV的表達量變化趨勢與NtSS相似，在煙葉成熟過程中呈先升高后降低再升高的趨勢，但不同品種烤煙NtINV的表達量在不同成熟時期差異較大；煙葉成熟時，豫煙6號NtINV表達量顯著高于秦?zé)?6和K326。

2.4 煙葉成熟期糖代謝關(guān)鍵酶活性、基因表達量與水溶性糖含量相關(guān)性

由表2可知，煙葉打頂至適熟階段，大部分水溶性糖（蔗糖除外）含量之間呈正相關(guān)，葡萄糖、果糖、麥芽糖與還原糖含量之間達顯著或極顯著正相關(guān)水平；而蔗糖含量與各水溶性糖含量之間相關(guān)性較弱。煙葉適熟至過熟階段，各水溶性糖含量之間相關(guān)性變化不大，與煙葉打頂至適熟階段水溶性糖含量之間相關(guān)性相似。

通過對烤煙成熟期糖代謝關(guān)鍵酶活性與相關(guān)基因表達量之間的相關(guān)分析，結(jié)果顯示（表3），煙葉打頂至適熟階段，SS、SPS與AI活性之間呈正相關(guān)，SS與AI之間達極顯著正相關(guān)水平（r=0.912，p<0.01）；NtSS、NtINV與SS、AI活性之間相關(guān)性均達到極顯著水平。煙葉適熟至過熟階段，大部分酶活性之間呈負相關(guān)；NtSS、NtINV與各酶活性之間相關(guān)性減弱，而NtSPS與AI、NI活性之間相關(guān)性則顯著增強；NtINV與NtSS、NtSPS之間相關(guān)性顯著減弱。

如表4所示，分別測定分析了烤煙打頂至適熟、適熟至過熟發(fā)育過程中糖代謝關(guān)鍵酶活性、基因表達量與水溶性糖含量之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，煙葉打頂至適熟階段，SS、SPS酶活性與水溶性糖含量之間呈正相關(guān)；AI酶活性與各水溶性糖（蔗糖除外）含量之間達顯著或極顯著正相關(guān)水平；大部分糖代謝相關(guān)基因與水溶性糖含量之間呈正相關(guān)，其中NtINV與各水溶性糖（蔗糖除外）含量之間相關(guān)性最強，分別達顯著或極顯著正相關(guān)水平。當煙葉由適熟至過熟時，SPS酶活性與各水溶性糖含量之間相關(guān)性減弱，而AI酶活性與各水溶性糖含量之間依然保持較高的相關(guān)性；NtSS、NtSPS與各水溶性糖含量之間相關(guān)性顯著增強，且呈負相關(guān)水平；NtINV與各水溶性糖含量之間相關(guān)性減弱。

3 討 論

烤煙成熟期糖代謝活動對煙葉品質(zhì)有重要影響[24]，糖分的運輸和分配是煙葉發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，決定了煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。烤煙糖代謝受遺傳因素、環(huán)境條件和栽培措施等的共同影響[25]，是一種多基因調(diào)控與環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。張曉遠等[26]研究表明，云煙87中部葉成熟過程中葉片還原糖和總糖含量相對較低，移栽后60 d其含量逐漸升高，煙葉成熟時含量最高，然后迅速下降。楊宇虹等[27]研究表明，水田烤煙煙葉果糖含量在旺長期最低，煙葉成熟時果糖含量顯著增加。本研究結(jié)果表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，煙葉從移栽后65 d至115 d的成熟過程中，3個品種烤煙水溶性糖組份含量變化趨勢基本一致，各水溶性糖（蔗糖除外）含量呈先升高后降低的變化趨勢，煙葉成熟時（移栽后95 d），其含量達到峰值；豫煙6號在煙葉成熟時具有較高的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性總糖含量，說明成熟期豫煙6號糖代謝較強，這可能與烤煙品種自身遺傳因素有關(guān)?？緹煶墒炱谡崽呛砍孰p峰波動的變化規(guī)律，這與魏慶華等[28]研究的成熟期蔗糖含量呈單峰曲線表現(xiàn)不同，這可能與煙葉成熟階段蔗糖大量轉(zhuǎn)化為淀粉等碳水化合物有關(guān)。

植物果實發(fā)育期間糖分積累強度與糖代謝相關(guān)酶活性緊密相連[29]，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶控制植物體內(nèi)碳素的分配和流向，可調(diào)控葉片中蔗糖的合成及總糖的積累；蔗糖轉(zhuǎn)化酶不可逆地催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，參與煙葉生長及器官建成。王樹會等[30]、賈宏昉等[17]研究表明，成熟期煙葉INV活性呈單峰變化，移栽后75～85 d其酶活性達到最大。本研究發(fā)現(xiàn)，秦?zé)?6、豫煙6號和K326的酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）活性變化趨勢相似，呈單峰曲線，與前人研究結(jié)果相似，但不同品種烤煙AI酶活性達到峰值的時期略有不同；煙葉成熟后，3個品種烤煙AI活性快速下降，說明煙葉進入衰老階段，葉片糖代謝減弱。3個品種烤煙NI活性在整個成熟期均較低，變化不顯著，說明NI在烤煙成熟期非煙葉糖代謝關(guān)鍵酶，進一步說明成熟期烤煙糖代謝活動主要發(fā)生在液泡中[31]。

大量研究表明糖代謝相關(guān)基因參與調(diào)控了煙葉的糖代謝[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個品種烤煙NtSS基因表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，這與王紅麗等[14]研究的NtSS基因表達量逐漸增強的規(guī)律有所不同，這是因為當煙葉由適熟至過熟的過程中，葉片內(nèi)糖代謝底物逐漸減少，煙葉糖代謝減弱，相應(yīng)的基因表達量下調(diào)；煙葉適熟時，K326葉片內(nèi)NtSS基因表達量顯著高于秦?zé)?6和豫煙6號；NtSPS基因表達量波動較大，移栽后115 d其表達量顯著上調(diào)；NtINV基因表達量呈單峰曲線變化，移栽后85 d達到峰值，這與牛德新等[15]研究結(jié)果一致。煙葉打頂后，3個品種烤煙糖代謝關(guān)鍵酶基因表達量均不同程度上調(diào)，說明煙葉進入成熟期糖代謝活動增強。秦?zé)?6、豫煙6號和K326各基因表達量在不同成熟階段存在一定差異，這可能與烤煙品種遺傳特性和適應(yīng)性有關(guān)。

綜合分析烤煙成熟期打頂至適熟、適熟至過熟發(fā)育階段糖代謝水溶性糖含量、酶活性及基因表達量之間關(guān)聯(lián)性可知，煙葉打頂至適熟階段，SPS、AI活性與各水溶性糖（蔗糖除外）含量之間相關(guān)性較強，而當煙葉適熟至過熟時，SPS活性與可溶性糖（蔗糖除外）含量之間相關(guān)性顯著降低，說明煙葉打頂至適熟階段SPS和AI活性對煙葉可溶性糖分積累有重要貢獻，而當煙葉進入過熟階段時，AI活性主要參與煙葉的糖代謝調(diào)控。煙葉適熟至過熟階段，SS、SPS活性與蔗糖含量相關(guān)性較強，說明SS和SPS酶活性對煙葉蔗糖的積累起重要作用?？緹煶墒炱诓煌A段糖代謝相關(guān)基因與可溶性糖含量之間相關(guān)性波動較大，說明不同發(fā)育階段調(diào)控?zé)熑~糖代謝的主要物質(zhì)不同。煙葉打頂至適熟階段，NtINV對煙葉糖代謝調(diào)控作用較大，而煙葉適熟至過熟階段，NtSS和NtSPS對煙葉糖代謝起主要的調(diào)控作用。綜合分析烤煙成熟過程中水溶性糖含量、糖代謝關(guān)鍵酶活性及相關(guān)基因表達量之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，煙葉糖代謝關(guān)鍵酶活性與可溶性糖含量相關(guān)性明顯高于相關(guān)基因與可溶性糖含量之間相關(guān)性，說明糖代謝關(guān)鍵酶直接參與煙葉糖代謝的調(diào)控，而糖代謝相關(guān)基因則是在分子層面對煙葉糖代謝進行調(diào)控。綜上所述，烤煙成熟期經(jīng)歷了復(fù)雜的生理生化變化過程，糖類往往作為信號分子，與激素、氮等信號協(xié)同調(diào)節(jié)糖代謝與基因表達，由此進一步表明煙葉糖代謝的復(fù)雜性。

4 結(jié) 論

在烤煙成熟期，煙葉內(nèi)葡萄糖、果糖、麥芽糖、還原糖和可溶性總糖含量總體呈先上升后下降的變化趨勢，葉片成熟時其含量達到峰值；成熟期蔗糖含量呈雙峰波動變化，煙葉成熟時蔗糖含量較低?？緹煶墒炱诓煌l(fā)育階段煙葉糖代謝分子調(diào)控機制不同，煙葉打頂至適熟階段，SPS和AI活性對煙葉中水溶性糖的積累貢獻最大，NtINV對煙葉糖代謝起主要調(diào)控作用；煙葉適熟至過熟階段，AI主要參與煙葉糖代謝活動，NtSS和NtSPS對煙葉糖代謝起主要調(diào)控作用。同一生態(tài)環(huán)境和栽培條件下，豫煙6號內(nèi)含物質(zhì)充實，具有較高的水溶性糖含量。本研究從分子生物學(xué)角度探究了不同品種烤煙成熟期糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達的規(guī)律，為煙葉品質(zhì)形成的分子作用機理奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]楊永鋒. 烤煙發(fā)育過程中有機和無機物含量變化規(guī)律研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

YANG Y F. Studies on the contents of organic matters and inorganic matters of tobacco leaves during the growth periods[D]. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2006.

[2]GUPTA A K， KAUR N. Sugar signalling and gene expression in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants[J]. Journal of Biosciences， 2005， 30（5）： 761-776.

[3]宮長榮. 煙草調(diào)制學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

GONG C R. Tobacco modulation[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2011.

[4]武雪萍，劉國順，朱凱，等. 施用有機酸對煙草生理特性及煙葉化學(xué)成分的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2003，9（2）：23-27.

WU X P， LIU G S， ZHU K， et al. Effect of applying organic acids on tobacco physiology and the leaf chemical components[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2003， 9（2）： 23-27.

[5]杜鮮云，程繼鴻，楊瑞，等. 春化處理對‘北農(nóng)1號蘿卜碳水化合物含量及相關(guān)酶活性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（11）：2303-2309.

DU X Y， CHENG J H， YANG R， et al. Effects of vernalization on carbohydrate content and sugar-metabolizing enzyme activities in radish[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（11）： 2303-2309.

[6]張海艷，董樹亭，高榮岐，等. 玉米籽粒淀粉積累及相關(guān)酶活性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（7）：2174-2181.

ZHANG H Y， DONG S T， GAO R Q， et al. Starch Accumulation and enzymes activities associated with starch synthesis in maize kernels[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2008， 41（7）： 2174-2181.

[7]李玉潛，謝九生，譚中文. 甘蔗葉片碳、氮代謝與產(chǎn)量、品質(zhì)關(guān)系研究初探[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28（4）：46-53.

LI Y Q， XIE J S， TAN Z W. Studies on the correlations among metabolisms of foliar carbohydrate and nitrogen， and cane yield and quality in sugarcane[J]. Scientia Agricultura Sinica， 1995， 28（4）： 46-53.

[8]呂英民，張大鵬，嚴海燕. 蘋果果實韌皮部及其周圍薄壁細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察和功能分析[J]. 植物學(xué)報，2000，42（1）：32-42.

LV Y M， ZHANG D P， YAN H Y. Ultrastructure of phloem and its surrounding parenchyma cells in the developing apple fruit[J]. Bulletin of Botany， 2000， 42（1）： 32-42.

[9]ZHANG D P， LU Y M， WANG Y Z， et al. Acid invertase is predominantly localized to cell walls of both the practically symplasmically isolated sieve element companion cell complex and parenchyma cells in developing apple fruits[J]. Plant Cell & Environment， 2001， 24（7）： 691-702.

[10]常尚連，于賢昌，于喜艷. 西瓜果實發(fā)育過程中糖分積累與相關(guān)酶活性的變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（3）：138-141.

CHANG S L， YU X C， YU X Y. Change of sugar accumulation and related enzyme activity during fruit development of watermelon[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2006， 15（3）： 138-141.

[11]CAI Q. Sucrose phosphate synthetase and sucrose synthetase activities to the different parts of tall fescue in low temperatures[J]. Acta Agrestia Sinica， 2004， 2（4）： 314-321.

[12]CHINCINSKA I A， LIESCHE J， KR?GEL U， et al. Sucrose Transporter StSUT4 from Potato Affects Flowering， Tuberization， and Shade Avoidance Response[J]. Plant Physiology， 2008， 146（2）： 515.

[13]NAKAMURA Y， YUKI K， PARK S Y， et al. Carbohydrate Metabolism in the Developing Endosperm of Rice Grains[J]. Plant & Cell Physiology， 1989， 30（6）： 833-839.

[14]王紅麗，楊惠娟，蘇菲，等. 氮用量對烤煙成熟期葉片碳氮代謝及萜類代謝相關(guān)基因表達的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2014，20（5）：116-120.

WANG H L， YANG H J， SU F， et al. Effects of nitrogen on expression of key genes related to carbon/nitrogen metabolism and terpenoid metabolism in matruing flue-cured tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（5）： 116-120.

[15]牛德新，連文力，崔紅，等. 施氮量對烤煙成熟期中部煙葉碳氮代謝及相關(guān)基因表達的影響[J]. 煙草科技，2017，49（8）：8-13.

NIU D X， LIAN W L， CUI H， et al. Effects of nitrogen application rate on carbon and nitrogen metabolisms and related gene expression in middle leaves of flue-cured tobacco at mature stage[J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 49（8）： 8-13.

[16]史宏志，李志，劉國順，等. 皖南焦甜香烤煙碳氮代謝差異分析及糖分積累變化動態(tài)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2009，24（3）：144-148.

SHI H Z， LI Z， LIU G S， et al. Dynamic changes of carbon-nitrogen metabolism and sugar accumulation in south anhui flue-cured tobacco with sweet aroma[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2009， 24（3）： 144-148.

[17]賈宏昉，陳紅麗，黃化剛，等. 施用腐熟秸稈肥對烤煙成熟期碳代謝途徑影響的初報[J]. 中國煙草學(xué)報，2014，20（4）：48-52.

JIA H F， CHEN H L， HUANG H G， et al. Preliminary report on effect of applying rotten straw fertilizer on carbon metabolism in maturing flue-cured tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（4）： 48-52.

[18]牛景，趙劍波，吳本宏，等. 不同來源桃種質(zhì)果實糖酸組分含量特點的研究[J]. 園藝學(xué)報，2006，33（1）：6-11.

NIU J， ZHAO J B， WU B H， et al. Sugar and acid contents in peach and nectarine derived from different countries and species[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2006， 33（1）： 6-11.

[19]GOMEZ L， RUBIO E， AUG? M. A new procedure for

extraction and measurement of soluble sugars in ligneous plants[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture， 2002， 82（4）： 360-369.

[20]WAN S B， TIAN L， TIAN R R， et al. Involvement of phospholipase D in the low temperature acclimation-induced thermotolerance in grape berry[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2009， 47（6）： 504-510.

[21]丁福章，李繼新，袁有波，等. 煙草不同組織總RNA的提取方法初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（12）：98-101.

DING F Z， LI J X， YUAN Y B， et al. Effective isolation of total RNA from tobacco tissues[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2007， 23（12）： 98-101.

[22]SCHMIDT G W， DELANEY S K. Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco （Nicotiana tabacum） during development and abiotic stress[J]. Molecular Genetics & Genomics， 2010， 283（3）： 233-241.

[23]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[24]黃樹永，陳良存. 煙草碳氮代謝研究進展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，34（4）：8-11.

HUANG S Y， CHEN L C. Research advance on carbon and nitrogen metabolism in tobacco[J]. Henan Agricultural Sciences， 2005， 34（4）： 8-11.

[25]張生杰，黃元炯，任慶成，等. 不同基因型烤煙煙葉碳氮代謝差異研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（3）：217-220.

ZHANG S J， HUANG Y J， REN Q C， et al. Differences in foliar carbon and nitrogen metabolism among genotypes of flue-cured tobacco[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2010， 25（3）： 217-220.

[26]張曉遠，劉國順，畢慶文，等. 烤煙成熟過程中部分酶活性及碳水化合物變化規(guī)律研究[J]. 中國煙草學(xué)報，2010，16（1）：45-48.

ZHANG X Y， LIU G S， BI Q W， et al. Study on enzyme and carbohydrate activities in flue-cured tobacco during maturing stage[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2010， 16（1）： 45-48.

[27]楊宇虹，趙正雄，李春儉，等. 不同氮形態(tài)和氮水平對水田與旱地烤煙煙葉糖含量及相關(guān)酶活性的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2009，15（6）：1386-1394.

YANG Y H， ZHAO Z X， LI C J， et al. Effects of nitrogen fertilization on carbohydrate content and related metabolic enzymes of flue-cured tobacco in paddy field and highland[J]. Plant Nutrition & Fertilizer Science， 2009， 15（6）： 1386-1394.

[28]魏慶華，杜錚，劉衛(wèi)群，等. 河南不同地區(qū)烤煙蔗糖含量及其代謝關(guān)鍵酶之間的關(guān)系分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23（1）：6-8，13.

WEI Q H， ZHENG D U， LIU W Q， et al. Analysis of relationship between sucrose content and sucrose metabolism key enzyme activity of flue-cured tobacco in different areas of henan province[J]. Acta Agricultural Jiangxi， 2011， 23（1）： 6-8， 13.

[29]VIZZOTTO G， PINTON R， VARANINI Z， et al. Sucrose accumulation in developing peach fruit[J]. Physiol Plant， 2010， 96（2）： 225-230.

[30]王樹會，趙憲鳳，劉衛(wèi)群. 植煙土壤對云南滇中烤煙碳氮代謝及其代謝產(chǎn)物動態(tài)變化的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，37（12）：62-66.

WANG S H， ZHAO X F， LIU W Q. Effects of Different soil types on carbon-nitrogen metabolism and metabolites changes of flue-cured tobacco in mid-yunnan[J]. Journal of Southwest China Normal University， 2012， 37（12）： 62-66.

[31]劉慧英，朱祝軍. 轉(zhuǎn)化酶在高等植物蔗糖代謝中的作用研究進展[J]. 植物學(xué)報，2002，19（6）：666-674.

LIU H Y， ZHU Z J. Advances on the studies of invertase on sucrose metabolism in higher plant[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2002， 19（6）： 666-674.

[32]蔣博文，王濤，宋朝鵬，等. 采后煙葉碳代謝的動態(tài)變化分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2018，39（1）：32-41.

JIANG B W， WANG T， SONG C P， et al. Dynamic analysis of carbon metabolism in tobacco leaves after harvest[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（1）： 32-41.