王帥 徐進(jìn) 許景升

摘要 本文將疊氮溴化丙錠（PMA）與熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了一種適于青枯菌不同小種菌株活細(xì)胞精準(zhǔn)、快速檢測(cè)的PMA-qPCR方法。通過單因素變化試驗(yàn)對(duì)PMA預(yù)處理反應(yīng)體系中的各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確立了PMA終濃度為15 ng/μL，黑暗孵育時(shí)間為10 min，曝光時(shí)間為5 min的PMA預(yù)處理體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)活菌比例大于10%，PMA-qPCR的測(cè)定結(jié)果均在理論活菌數(shù)相對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)。檢測(cè)靈敏度測(cè)試結(jié)果顯示，該方法適用于活菌數(shù)在5.0×10.2～5.0×10.8 cfu/mL范圍內(nèi)菌懸液的檢測(cè)。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范圍內(nèi)有效去除青枯菌死菌的干擾，定量檢測(cè)出活菌數(shù)量，研究結(jié)果可為植物細(xì)菌性青枯病的流行規(guī)律研究提供新的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 PMA-qPCR； 青枯菌； 活菌檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S 435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017483

Abstract By combining propidium monoazide （PMA） with fluorogenic （TaqMan） PCR， we developed a novel method for specific detection of viable cells ofRalstonia solanacearum at species level. We optimized various parameters of PMA by single factor change test to establish the system of PMA pre-treatment. The optimal conditions for PMA-qPCR were： a final concentration of PMA of 15 ng/ mL， a dark incubation time of 10 min， and an exposure time of 5 min. The test results showed that， within the range of 50×10.2-5.0×10.8 cfu/mL， when the proportion of viable bacteria was greater than 10%， the results of PMA-qPCR were almost identical with the theoretical values. The method could effectively remove the interference of the dead cells ofR.solanacearum and quantitatively detect the number of viable cells， thereby providing a new technical support for the research of epidemiology of bacterial wilt caused byR.solanacearum.

Key words PMA-qPCR； Ralstonia solanacearum； viable cell detection

植物細(xì)菌性青枯?。╞acterial wilt of plants）是由茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum Yabuuchi（簡(jiǎn)稱青枯菌）引起的一種世界性重大病害。青枯菌菌系復(fù)雜，寄主范圍廣泛，可侵染包括馬鈴薯、生姜、番茄、辣椒等重要經(jīng)濟(jì)作物在內(nèi)的54科450余種植物[1-2]。青枯病是熱帶、亞熱帶以及溫帶某些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因子，且近幾十年來，該病逐漸向高緯度、冷涼區(qū)域擴(kuò)散蔓延[3]。迄今為止，青枯病的有效防控仍是難以突破的世界性瓶頸問題。建立精確、靈敏、高效的早期診斷技術(shù)，是有效阻斷青枯病傳播擴(kuò)散，制定科學(xué)防控策略的基石。2001年，Grey等首次報(bào)道了銅制劑可誘導(dǎo)青枯菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)（viable but nonculturable， VBNC）狀態(tài)[4]，VBNC狀態(tài)的青枯菌失去了在傳統(tǒng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的能力，因此采用常規(guī)平板培養(yǎng)方法會(huì)造成假陰性檢測(cè)結(jié)果[4]；而常規(guī)的PCR檢測(cè)技術(shù)不僅能擴(kuò)增活菌細(xì)胞DNA，也會(huì)擴(kuò)增死菌細(xì)胞DNA以及游離狀態(tài)的DNA分子，致使假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。目前已報(bào)道的青枯菌活菌檢測(cè)主要基于膜完整性的檢測(cè)方法和基于代謝活性的檢測(cè)方法?；谀ね暾缘臋z測(cè)方法主要分為兩類，一類是用SYTO9和碘化丙啶（PI）對(duì)青枯菌染色后結(jié)合熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[4-9]；另一類是用疊氮溴化丙錠（propidium monoazide， PMA）或疊氮溴化乙錠（ethidium monoazide bromide， EMA）預(yù)處理，再通過PCR或qPCR進(jìn)行檢測(cè)[10-12]。這兩類檢測(cè)方法是目前青枯菌VBNC研究中常用的方法。基于代謝活性的檢測(cè)較為經(jīng)典的方法有CTC法和DVC法[4-5，13]。本研究以VBNC狀態(tài)青枯菌的定量檢測(cè)為出發(fā)點(diǎn)，利用PMA對(duì)活/死細(xì)胞具有選擇性的特性，將PMA與熒光定量PCR相結(jié)合用于青枯菌活菌檢測(cè)。對(duì)PMA作用于青枯菌的最佳濃度、黑暗孵育時(shí)間以及曝光時(shí)間進(jìn)行摸索。本文針對(duì)樣品中活的以及VBNC狀態(tài)的青枯菌，旨在建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)且可定量檢測(cè)青枯菌的方法，藉此為帶菌植物繁殖材料的檢測(cè)與青枯病防治效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

番茄品種‘中雜106號(hào)購(gòu)自北京中農(nóng)良種公司；供試的青枯菌Z-Aq-1菌株由筆者實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

疊氮溴化丙錠（PMA）購(gòu)自美國(guó)Biotium公司；Probe qPCR Mix購(gòu)自TaKaRa公司；650 W鹵鎢燈購(gòu)自德國(guó)Osram公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司； SPECORD40紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Analytik Jena AG公司；INFORS Ecotron 振蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自瑞士INFORS公司；Memmert IN55培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)美爾特公司。

NB （nutrient broth）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，多聚蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，酵母提取物0.5 g，用蒸餾水定容到1 000 mL，調(diào)節(jié)pH=7.0，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加1.8%瓊脂。改良的選擇性NA培養(yǎng)基（mNA）：NB 培養(yǎng)基中添加多黏菌素（polymixin-B-sulphate）至終濃度20 mg/mL，桿菌肽（bacitracin）至終濃度5 mg/mL，氯霉素（chloramphenicol）至終濃度1 mg/mL，青霉素（penicillin-G）至終濃度5 mg/mL，TZC存儲(chǔ)液[1%紅四氮唑（C19H15ClN4）115℃滅菌7～8 min]至終濃度50 mg/L?？股卦谂囵B(yǎng)基45～50℃時(shí)加入。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

使用接種環(huán)蘸取室溫下保存在無菌水中的Z-Aq-1菌懸液， 于mNA培養(yǎng)基上劃線。 28℃條件下培養(yǎng)48～72 h后， 挑取典型的青枯菌野生型菌落， 經(jīng)PCR驗(yàn)證后轉(zhuǎn)至普通NA培養(yǎng)平板。28℃條件下培養(yǎng)48～72 h后， 挑取菌膿于NB液中28℃振蕩培養(yǎng)至A600=0.8～1.0（菌懸液濃度為1.0×10.9～3.0×10.9 cfu/mL）。取1 mL上述菌液至1.5 mL離心管中， 12 000 r/min， 離心5 min，棄上清，等體積無菌水反復(fù)洗滌3次后，懸浮于1 mL無菌水中， 100℃水浴30 min， 獲得熱滅活的死菌細(xì)胞懸浮液。

1.2.2 PMA質(zhì)量濃度的優(yōu)化

稱取1 mg PMA溶解于200 μL 20%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，得到質(zhì)量濃度為5 μg/μL的貯存液， 于-20℃保存。使用前將貯存液稀釋為0.5 μg/μL的工作液。將不同體積的PMA工作液添加到500 μL濃度為10.9 cfu/mL的活菌菌懸液中， 充分混勻，獲得PMA 最終質(zhì)量濃度分別為0、5、10、15 和20 ng/μL；同樣方法對(duì)熱滅殺的死亡菌體懸浮液進(jìn)行處理。將全部處理的菌懸液置于黑暗處孵育10 min， 隨后，開蓋向上置于冰上， 在距離650 W鹵鎢燈15 cm處均勻曝光5 min， 曝光結(jié)束后， 取4 μL 菌體懸浮液作為模板分別進(jìn)行熒光定量PCR。通過7500 Software V 2.3 采集循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct） 。每次試驗(yàn)設(shè)5個(gè)平行樣，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PMA預(yù)處理黑暗孵育時(shí)間的優(yōu)化

分別添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌懸液和熱滅活死菌菌懸液中，充分混勻，獲得PMA最終質(zhì)量濃度為15 ng/μL，隨后置于黑暗處孵育。設(shè)置孵育時(shí)間為0、2、5、10 和15 min，其后的操作步驟同1.2.2。每次試驗(yàn)設(shè)5個(gè)平行樣，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 PMA預(yù)處理最優(yōu)曝光時(shí)間的選擇

分別添加PMA工作液于500 μL 10.9 cfu/mL活菌菌懸液和熱滅活死菌菌懸液中，充分混勻，獲得PMA最終質(zhì)量濃度為15 ng/μL，置于黑暗處孵育10 min后，開蓋向上置于冰上，在距離650 W鹵鎢燈15 cm處分別均勻曝光0、2、5、10 和15 min，其后操作步驟同1.2.2。每次試驗(yàn)設(shè)5個(gè)平行樣，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 熒光PCR檢測(cè)體系

利用ABI 7500 Real-Time PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。參考Weller等[14]的報(bào)道合成引物和探針。上游引物RS-I-F：5′-GCATGCCTTACACATGCAAGTC-3′；下游引物RS-II-R：5′-GGCACGTTCCGATGTATTACTCA-3′。Taqman探針RS-Pb的5和3端分別以熒光報(bào)告基團(tuán)（FAM）和淬滅基團(tuán)（TAMRA）進(jìn)行標(biāo)記 （5′-FAM-AGCTTGCTACCTGCCGGCGAGTG-TAMRA-3′）。引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系（50 μL）為：Probe qPCR Mix（2×）25 μL， 上游引物（10 μmol/L） 1 μL，下游引物 （10 μmol/L） 1 μL，探針2 μL，ROX DyeⅡ （50×）0.5 μL，模板4 μL，超純水16.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min （收集熒光信號(hào)），共40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 PMA-qPCR檢測(cè)不同比例的活菌

將熱滅活死菌與同濃度活菌按不同比例混合以制得活菌占比分別為0、10%、20%、50%、80%、90%、100%的活菌/死菌混合液，待測(cè)。

另取1 mL處于對(duì)數(shù)期的新鮮活菌（A600=0.8～1.2）于1.5 mL離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，等體積無菌水反復(fù)洗滌3次后，懸浮于1 mL無菌水中，10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，分別得到稀釋10.0、10.1、10.2、10.3、10.4倍的菌懸液，作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品液。

吸取500 μL待測(cè)活菌/死菌混合液和標(biāo)準(zhǔn)樣品液按照優(yōu)化條件進(jìn)行PMA預(yù)處理。隨后取4 μL菌懸液作為模板進(jìn)行熒光定量PCR。同時(shí)，分別取100 μL不同稀釋倍數(shù)的樣品液涂布平板，用以計(jì)算樣品液中的活菌數(shù)。根據(jù)熒光定量PCR后7500 Software V 2.3 采集的不同比例活菌菌懸液的Ct值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到不同比例活菌/死菌混合液中的活菌數(shù)。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 PMA-qPCR靈敏度檢測(cè)

濃度為1.0×10.9 cfu/mL的活菌及熱滅活死菌菌懸液同體積混合后，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別獲得濃度為5.0×10.8、5.0×10.7、5.0×10.6、5.0×10.5、5.0×10.4、5.0×10.3、5.0×10.2、5.0×10.1、5.0×10.0cfu/mL的待測(cè)菌懸液。同時(shí)，如1.2.6所述建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過7500 Software V 2.3 采集不同處理菌懸液的Ct值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到不同混合液中的活菌數(shù)。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA預(yù)處理反應(yīng)體系優(yōu)化

2.1.1 PMA質(zhì)量濃度的優(yōu)化

使用PMA對(duì)青枯菌活菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，隨著PMA處理濃度的增加，活菌擴(kuò)增的Ct值無顯著變化（圖1），這是因?yàn)榛罹募?xì)胞膜完整，而PMA不能透過完整的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA分子結(jié)合。而使用PMA對(duì)熱滅活死菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，當(dāng)PMA的濃度在0～15 ng/μL時(shí)，隨著PMA處理濃度的升高，擴(kuò)增的Ct值顯著增加，這是因?yàn)榈蜐舛鹊腜MA不能完全與死菌細(xì)胞的DNA結(jié)合，從而不能最大限度地抑制死菌細(xì)胞的DNA擴(kuò)增。當(dāng)PMA濃度為20 ng/μL時(shí)與15 ng/μL無顯著差異，說明PMA濃度為15 ng/μL時(shí)已可最大限度地抑制死菌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。因此，選擇15 ng/μL作為PMA預(yù)處理的最優(yōu)濃度。

2.1.2 PMA預(yù)處理黑暗孵育時(shí)間的優(yōu)化

黑暗孵育時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)表明，隨著黑暗孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌擴(kuò)增的Ct值無顯著變化（圖2），這是因?yàn)镻MA不能進(jìn)入到活細(xì)胞內(nèi)與DNA分子結(jié)合，而在隨后的曝光處理過程中被光解，并未對(duì)后續(xù)的熒光定量PCR產(chǎn)生影響。而使用PMA對(duì)熱滅活死菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，當(dāng)黑暗孵育時(shí)間小于10 min時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，擴(kuò)增的Ct值顯著增加，這是因?yàn)樵诤诎捣跤^程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PMA與熱致死細(xì)胞DNA的交聯(lián)結(jié)合率升高，從而對(duì)死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的抑制作用增強(qiáng)，而黑暗孵育10 min與15 min的Ct值無顯著差異，說明黑暗孵育10 min可使得PMA與熱致死細(xì)胞的DNA最大程度地結(jié)合，從而有效避免死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。因此，選擇10 min作為PMA預(yù)處理的最優(yōu)黑暗孵育時(shí)間。

2.1.3 PMA預(yù)處理最優(yōu)曝光時(shí)間的選擇

由圖3可知，使用PMA對(duì)活菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，當(dāng)曝光時(shí)間小于5 min時(shí)，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值逐漸降低，這是因?yàn)槠毓鈺r(shí)間過短，不能使殘留的PMA完全光解，從而對(duì)后續(xù)的熒光定量PCR產(chǎn)生抑制作用，而曝光時(shí)間大于5 min時(shí)，各處理活菌的Ct值無顯著差異，說明曝光時(shí)間大于5 min，可使殘留的PMA完全光解從而消除殘留PMA對(duì)后續(xù)qPCR的影響。使用PMA對(duì)熱滅活死菌進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，當(dāng)曝光時(shí)間小于5 min時(shí)，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值逐漸增加，這是因?yàn)槠毓鈺r(shí)間增加，殘留PMA的光解率升高，對(duì)DNA擴(kuò)增的抑制作用減弱，而曝光時(shí)間大于5 min時(shí)，各處理死菌的Ct值無顯著差異，進(jìn)一步說明曝光5 min足以使殘留的PMA完全光解。因此，選擇5 min作為PMA預(yù)處理的最優(yōu)曝光時(shí)間。

2.2 PMA-qPCR檢測(cè)不同比例的活菌

將處于對(duì)數(shù)期的新鮮活菌懸液（濃度約為10.9 cfu/mL），10倍梯度稀釋，得到活菌濃度梯度為10.5 ～10.9 cfu/mL的活菌菌懸液，再進(jìn)行PMA-qPCR，活菌細(xì)胞數(shù)量與Ct的相關(guān)性如圖4所示。由Ct值與不同活菌濃度產(chǎn)生的線性回歸表明，兩者之間具有明顯的相關(guān)性（R.2=0.999），且擴(kuò)增效率良好（Eff%： 91.577），由PMA-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增峰圖（圖5）也能更直觀地看出應(yīng)用此方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

由表1可知，當(dāng)理論活菌比例為0%，理論活菌數(shù)為0 cfu/mL時(shí)，PMA-qPCR的測(cè)定結(jié)果為10.6 cfu/mL與理論值存在極顯著差異，且理論值不在對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)。而當(dāng)理論活菌比例分別為10%、20%、50%、80%、90%、100%時(shí)，PMA-qPCR的測(cè)定結(jié)果與理論活菌數(shù)均在同一數(shù)量級(jí)，且理論活菌數(shù)均在相對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)。由圖6可以看出，當(dāng)活菌比例大于10%時(shí)，理論值與實(shí)測(cè)值之間呈良好的線性關(guān)系，這說明，當(dāng)活菌比例在10%～100%時(shí)，應(yīng)用該方法完全可以估計(jì)青枯菌的活菌數(shù)量，但當(dāng)活菌比例小于10%，且死菌的濃度大于10.3 cfu/mL時(shí)，應(yīng)用該P(yáng)MA-qPCR檢測(cè)活菌數(shù)量可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.3 PMA-qPCR檢測(cè)青枯菌活菌的靈敏度

由表2可知，當(dāng)理論活菌數(shù)為5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL之間時(shí)，PMA-qPCR測(cè)定結(jié)果顯示：活菌數(shù)雖與理論活菌數(shù)不完全一致，但均維持在相對(duì)應(yīng)的數(shù)量級(jí)上，且理論活菌數(shù)均在相對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)。而當(dāng)理論活菌數(shù)小于等于5.0×10.1cfu/mL時(shí)，PMA-qPCR測(cè)定結(jié)果顯示的活菌數(shù)遠(yuǎn)高于理論值，且理論活菌數(shù)不在相對(duì)應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)（表2）。由圖7可知，活菌濃度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL時(shí)，理論值與實(shí)測(cè)值之間有良好的線性關(guān)系，說明當(dāng)活菌濃度在5.0×10.2～5.0×10.8cfu/mL范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)用PMA-qPCR方法檢測(cè)可以較客觀地反映實(shí)際活菌數(shù)量，根據(jù)回歸方程y=0.991 3x+0.015 1，也可計(jì)算出更接近理論值的活菌數(shù)量，而當(dāng)活菌濃度小于5.0×10.2 cfu/mL時(shí)，應(yīng)用該反應(yīng)體系檢測(cè)青枯菌活菌數(shù)量則受到局限。

3 討論

近年來，隨著我國(guó)馬鈴薯、生姜和番茄等作物種植面積的不斷擴(kuò)大，集約化生產(chǎn)水平的逐步提高，青枯病已成為我國(guó)常見、易發(fā)和傳播迅速的重要土傳病害之一[15-16]。目前國(guó)內(nèi)南起20°N的海南省、北至42°N的河北壩上地區(qū)均有該病發(fā)生危害的報(bào)道[17]。然而青枯病的防治，迄今仍是生產(chǎn)實(shí)際中有待突破的難題之一。青枯菌在脫離寄主植物的土棲生活過程中，可能通過進(jìn)入VBNC狀態(tài)以應(yīng)對(duì)干旱、寡營(yíng)養(yǎng)和重金屬等逆境脅迫，并在其成功完成侵染循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。常規(guī)分離培養(yǎng)和分子檢測(cè)方法，或因青枯菌的VBNC狀態(tài)而造成假陰性檢測(cè)結(jié)果，或因死亡菌體細(xì)胞釋放出的游離DNA造成假陽性結(jié)果。因此，建立精準(zhǔn)、可靠的青枯菌活細(xì)胞定量檢測(cè)方法，對(duì)于深入探究青枯病的生態(tài)流行學(xué)規(guī)律，阻斷疫情隨帶菌植物繁殖材料擴(kuò)散傳播，篩選評(píng)價(jià)不同防控策略的效果具有重要意義。

作為光敏DNA染料，PMA和EMA均無法進(jìn)入具完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的菌體內(nèi)，但可與游離DNA通過共價(jià)氮碳鍵穩(wěn)定結(jié)合，進(jìn)而抑制隨后的基于DNA擴(kuò)增技術(shù)的分子檢測(cè)陽性信號(hào)的產(chǎn)生。利用這一原理，Nogva等[18]2003年首次報(bào)道了基于EMA-qPCR技術(shù)的大腸桿菌Escherichia coli、沙門氏菌Salmonella spp.和單增李斯特菌Listeria monocytogenes的活菌定量檢測(cè)技術(shù)。此后該方法被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)和環(huán)境科學(xué)等諸多研究領(lǐng)域的病原微生物和環(huán)境活菌的檢測(cè)，2008年Luo等[19]首次將EMA-qPCR技術(shù)應(yīng)用于植物病原細(xì)菌學(xué)研究領(lǐng)域，建立番茄細(xì)菌性潰瘍病菌Clavibacter michiganensissubsp. michiganensis的活菌定量檢測(cè)方法。2013年熊書等[12]建立了針對(duì)青枯菌的EMA-qPCR活體檢測(cè)方法，可以定量區(qū)分出青枯菌死亡菌體細(xì)胞和處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞。近年來，越來越多的相關(guān)研究表明EMA可進(jìn)入某些種類細(xì)菌的活細(xì)胞內(nèi)，并與DNA分子結(jié)合，使其不僅抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增，也抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增。反之，PMA較EMA多一個(gè)正電荷，更難于進(jìn)入細(xì)菌活體細(xì)胞內(nèi)，使得PMA在選擇性抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增方面更具優(yōu)勢(shì)[20-21]。

近年來，基于PMA的PCR或qPCR技術(shù)已成為檢測(cè)細(xì)菌活菌的研究熱點(diǎn)。在青枯菌研究領(lǐng)域，曹夢(mèng)琪等[11]建立了青枯菌5號(hào)生理小種的PMA-qPCR定量檢測(cè)方法，2016年于小龍等[10]將PMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速有效區(qū)分青枯菌死/活細(xì)胞的分子檢測(cè)方法。但這兩種基于PMA的檢測(cè)方法均存在一定的局限性，前者僅針對(duì)青枯菌5號(hào)小種的活菌檢測(cè)，對(duì)其他小種菌株無效；后者無法實(shí)現(xiàn)樣品活菌細(xì)胞的定量檢測(cè)。

作為復(fù)合種，青枯菌群體異常復(fù)雜多樣，為確保檢測(cè)方法的特異性與通用性，本研究基于歐洲和地中海植物保護(hù)組織和美國(guó)農(nóng)業(yè)部青枯菌檢測(cè)規(guī)程中推薦使用的TaqMan檢測(cè)方法[14]，結(jié)合PMA預(yù)處理建立了一種適用性更廣、靈敏度更高的青枯菌活菌定量檢測(cè)體系。Weller等[14]的研究結(jié)果中顯示RS-I-F/RS-II-R適合青枯菌所有生理小種和生化變種的qPCR檢測(cè)，我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中選取了具有代表性且在Weller等研究中未提到的1號(hào)小種GMI1000、2號(hào)小種Po82、3號(hào)小種Po41、4號(hào)小種Aq以及5號(hào)小種M7等菌株進(jìn)行了引物通用性驗(yàn)證，結(jié)果表明RS-I-F/RS-II-R適用于5個(gè)小種的PCR擴(kuò)增，為了節(jié)約試驗(yàn)的周期和成本，我們選取侵染生姜的4號(hào)小種Aq菌株作為本次試驗(yàn)的研究對(duì)象。相比于SYTO9 和PI染色后通過顯微觀察的檢測(cè)方法只適用于純培養(yǎng)青枯菌的活/死菌計(jì)數(shù)，該方法具有明顯的特異性，可以排除非靶標(biāo)菌的干擾，因此適用性和實(shí)用性更強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，PMA終濃度為15 ng/μL，是抑制10.9 cfu/mL 濃度青枯菌死菌的最優(yōu)濃度，黑暗處理10 min為PMA的最優(yōu)孵育時(shí)間，鹵素?zé)粝缕毓? min為去除殘留PMA分子的最優(yōu)曝光時(shí)間。以上結(jié)果與曹夢(mèng)琪等建立的青枯菌5號(hào)小種PMA預(yù)處理體系基本一致[11]；與熊書等建立的青枯菌EMA預(yù)處理體系相比，黑暗孵育時(shí)間有所延長(zhǎng)，曝光時(shí)間有所縮短[12]，這可能與使用的染料以及菌液濃度有關(guān)。在死、活菌混合體系中， 本研究建立的PMA-qPCR檢測(cè)方法的青枯菌活菌檢測(cè)下限為5.0×10.2 cfu/mL，靈敏度略高于熊書等報(bào)道的5.0×10.0個(gè)/反應(yīng)（2.5×10.3 cfu/mL）以及曹夢(mèng)琪等報(bào)道的10.3 cfu/mL[11-12]。本研究使用PMA-qPCR檢測(cè)不同比例的活菌時(shí)，當(dāng)活菌濃度為0 cfu/mL，死菌濃度為1.0×10.9 cfu/mL時(shí)，PMA-qPCR的定量檢測(cè)結(jié)果為2.64×10.6 cfu/mL，與理論值差異顯著。Li等在運(yùn)用PMA-qPCR 法檢測(cè)沙門氏菌屬時(shí)發(fā)現(xiàn)PMA 對(duì)死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的抑制效果與靶基因擴(kuò)增長(zhǎng)度之間存在良好的相關(guān)性，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度越長(zhǎng)，對(duì)死菌DNA抑制效果越好，擴(kuò)增的基因片段較短時(shí)無法完全抑制高濃度死菌DNA的擴(kuò)增[22]，這可能是造成上述現(xiàn)象的原因之一。但該現(xiàn)象并不影響PMA-qPCR在一定范圍的實(shí)際應(yīng)用，當(dāng)活菌的百分比大于1%或死菌比例小于99%時(shí)，使用該方法完全可以準(zhǔn)確地測(cè)定青枯菌活菌的數(shù)量。

綜上所述，目前青枯菌活菌的檢測(cè)主要包括SYTO9和PI結(jié)合熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細(xì)胞儀、PMA/EMA結(jié)合PCR或qPCR的檢測(cè)方法，這些方法各有利弊，當(dāng)前單一方法由于在某種程度上缺乏一定的科學(xué)性，因此為了更準(zhǔn)確地在樣品中檢驗(yàn)出活的以及VBNC狀態(tài)細(xì)菌，就需要結(jié)合多種方法從多種判斷角度更加完整準(zhǔn)確地進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究建立的PMA-qPCR檢測(cè)方法能從混合狀態(tài)下的純培養(yǎng)菌中特異性定量檢測(cè)出青枯菌的活菌數(shù)量， 為青枯菌活菌以及VBNC狀態(tài)菌的檢測(cè)提供了科學(xué)的參考依據(jù)，為植物繁殖材料的帶菌檢測(cè)與青枯病防控效果評(píng)價(jià)提供可靠的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] WICKER E， GRASSART L， CORANSON-BEAUDU R， et al.Ralstonia solanacearumstrains from Martinique. （French West Indies） exhibiting a new pathogenic potential [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 71（21）： 6790-6801.

[2] XU J， PAN Z C， PRIOR P， et al. Genetic diversity ofRalstonia solanacearumstrains from China [J]. European Journal of Plant Pathology， 2009， 125（4）： 641-653.

[3] IMAZAKI I， NAKAHO K. Pyruvate-amended modified SMSA medium： improved sensitivity for detection ofRalstonia solanacearum [J]. Journal of General Plant Pathology， 2010， 76（1）： 52-61.

[4] GREY B E， STECK T R.The viable but nonculturable state ofRalstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2001， 67（9）： 3866-3872.

[5] ALVAREZ B， LOPEZ M M， BIOSCA E G. Survival strategies and pathogenicity ofRalstonia solanacearum phylotype II subjected to prolonged starvation in environmental water microcosms [J]. Microbiology， 2008， 154（11）： 3590-3598.

[6] IMAZAKI I， NAKAHO K. Temperature-upshift-mediated revival from the sodium-pyruvate-recoverable viable but nonculturable state induced by low temperature inRalstonia solanacearum： linear regression analysis [J]. Journal of General Plant Pathology， 2009， 75（3）： 213-226.

[7] VAN OVERBEEK L S， BERGERVOET J H， JACOBS F H， et al. The low-temperature-induced viable-but-nonculturable state affects the virulence ofRalstonia solanacearum Biovar 2 [J]. Phytopathology， 2004， 94（5）： 463-469.

[8] YOUNG U H， KONG H G， JU L H， et al. Altered gene expression and intracellular changes of the viable but nonculturable state inRalstonia solanacearum by copper treatment [J]. Plant Pathology Journal， 2013， 29（4）： 374-385.

[9] BIOSCA E G， CARUSO P， BERTOLINI E， et al. Improved detection ofRalstonia solanacearum in culturable and VBNC state from water samples at low temperatures [M]∥ALLEN C， PRIOR P， HAYWARD A C. Bacterial wilt disease and theRalstonia solanacearum species complex St.Paul， USA： APS Press， 2005： 501-506.

[10]于小龍， 徐進(jìn)， 張昊， 等. PMA-PCR方法快速檢測(cè)VBNC狀態(tài)青枯菌[J]. 植物保護(hù)， 2016， 42（1）： 144-149.

[11]曹夢(mèng)琪， 王旭東， 王俊， 等. 基于PMA-qPCR檢測(cè)青枯菌5號(hào)生理小種活菌的方法[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2015（6）： 1004-1010.

[12]熊書，殷幼平，王芳，等.基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活體檢測(cè)技術(shù)的建立[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（9）：1723-1732.

[13]KONG H G， BAE J Y， LEE H J， et al. Induction of the viable but nonculturable state ofRalstonia solanacearum by low temperature in the soil microcosm and its resuscitation by catalase [J/OL]. PLoS ONE， 2014， 9（10）： e109792.

[14]WELLER S A， ELPHINSTONE J G， SMITH N C， et al. Detection ofRalstonia solanacearum strains with a quantitative， multiplex， real-time， fluorogenic PCR （TaqMan） assay[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2000， 66（7）： 2853.

[15]HE L Y， SEQUEIRA L， KELMAN A. Characteristics of strains ofPseudomonas solanacearum [J].Plant Disease，1983，67：1357-1361.

[16]喬俊卿， 陳志誼， 劉郵洲， 等. 茄科作物青枯病研究進(jìn)展[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2013， 43（1）： 1-10.

[17]徐進(jìn)， 馮潔. 植物青枯菌遺傳多樣性及致病基因組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（14）： 2902-2909.

[18]NOGVA H K， DRMTORP S M， NISSEN H， et al. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR [J]. BioTechniques， 2003， 34（4）： 812-813.

[19]LUO L X， WALTERS C， BOLKAN H， et al. Quantification of viable cells ofClavibacter michiganensis， subsp.michiganensis， using a DNA binding dye and a real-time PCR assay[J]. Plant Pathology， 2008， 57（2）： 332-337.

[20]NOCKER A， CHEUNG C Y， CAMPER A K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells [J].Journal of Microbiological Methods，2006，67（2）： 310-320.

[21]CAWTHORN D M， WITTHUHN R C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide [J]. Journal of Applied Microbiology， 2008， 105（4）： 1178.

[22]LI B， CHEN J Q. Development of a sensitive and specific qPCR assay in conjunction with propidium monoazide for enhanced detection of liveSalmonella， spp. in food [J]. BMC Microbiology， 2013， 13（1）： 1-13.

（責(zé)任編輯：楊明麗）