廖瑜露 李 俊 萬以葉 彭麗香 廖瑜倩

全世界范圍內(nèi)，胃癌是第5大最常見惡性腫瘤，死亡率在惡性腫瘤中居第三位[1]。早期胃癌可能通過根治性手術(shù)及輔助化療等治療手段達到治愈。兩項隨機、Ⅲ期臨床研究證實，在根治性手術(shù)的基礎(chǔ)上給予替吉奧[2]或奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱[3]方案輔助治療可進一步提高生存期。

miRNA生物合成的關(guān)鍵基因如DICER、RAN、XPO、EPO、GEMIN可能與黑色素瘤、卵巢癌和T細胞淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4-6]。本研究在接受奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物術(shù)后輔助化療的早期及局部晚期胃癌患者中分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs2257082，XPO5 rs11077遺傳變異與患者無病生存期(DFS)和總生存期(OS)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2011年1月至2012年12月在我院就診、病例資料較為完整、接受根治性手術(shù)，接受奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物術(shù)后輔助化療的胃腺癌患者96例。根據(jù)AJCC分期(美國癌癥分期聯(lián)合委員會，2010年第7版)為Ⅰ～Ⅲ期[7]。排除接受姑息性手術(shù)、接受過術(shù)前化療或放療的患者。

1.2 治療方法

奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物方案輔助化療[8-9]。具體方案：① 71例患者使用mFOLFOX6方案，奧沙利鉑85 mg/m2第1天+亞葉酸鈣400 mg/m2第1天+氟尿嘧啶400 mg/m2第1天，靜脈推注+氟尿嘧啶2 400 mg/m2持續(xù)泵入46 h，14天為1個周期，共12個周期。②12例患者使用奧沙利鉑130 mg/m2第1天+亞葉酸鈣300 mg第1～4天+替加氟1 g第1～4天，21天為1個周期×8個周期。③8例患者使用XELOX方案，奧沙利鉑130 mg/m2+卡培他濱1 000 mg/m2bid第1～14天口服，21天為1個周期×8個周期。④5例患者使用SOX方案，奧沙利鉑130 mg/m2+替吉奧40～60 mg bid 第1～14天口服，21天為1個周期×8個周期。

1.3 SNP檢測方法

化療前采集所有患者的外周血標本5 ml。采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取基因組DNA。采用MassARRAY MALDI-TOF 系統(tǒng)進行基因分型[10]，由北京博淼生物公司進行。檢測位點：DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs11077和XPO5 rs2257082。所有標本檢測兩次，并設(shè)立不含DNA的陰性對照。兩次檢測的一致率為100%[8]。見表1。

表1 PCR引物

1.4 研究終點和統(tǒng)計學方法

每3個月進行影像學檢查了解患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。無病生存期(DFS，disease-free survival)指從手術(shù)確診開始至出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間?？偵嫫?OS，overall survival)指從手術(shù)確診至因任何原因死亡或末次隨訪的時間。統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。采用Kaplan-Meier 法進行單因素生存分析，組間比較采用Log-rank檢驗，采用COX風險比例模型進行多因素預(yù)后分析。

2 結(jié)果

2.1 全組患者基本特征

全組患者中位年齡54歲(19～79歲)。年齡<60歲及≥60歲的患者分別為67例(69.8%)和29例(30.2%)。67例患者為男性(69.8%)。僅有8例患者病灶位于賁門部(8.3%)。高中分化腺癌26例(27.1%)，低分化腺癌及印戒細胞癌患者70例(72.9%)。絕大多數(shù)患者為T3-4(77例，80.2%)。多數(shù)患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(68例，70.8%)。Ⅲ期患者60例(62.5%)，見表2。

2.2 臨床病理特征與DFS和OS的關(guān)系

全組患者2年DFS為60.5%，3年OS為73.2%。分析臨床病理特征與DFS、OS的相關(guān)性。結(jié)果顯示，T1-2患者的2年DFS顯著高于T3-4患者，分別為88.2%和53.1%(P=0.014)。臨床分期與2年DFS顯著相關(guān)，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者2年DFS分別為100.0%、66.5%和50.4%(P=0.023)。

N分期(P=0.017)、臨床分期(P=0.020)與3年OS顯著相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的3年OS顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，分別為63.7%和88.6%。見表2。

表2 臨床病理特征與患者生存的關(guān)系/%

2.3 基因型與DFS和OS的關(guān)系

分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs11077，XPO5 rs2257082基因型與2年DFS及3年OS的關(guān)系，結(jié)果提示，XPO5 rs11077基因型與3年OS顯著相關(guān)，AC基因型患者的3年OS顯著低于AA基因型患者，見表3。

多因素預(yù)后分析顯示，淋巴結(jié)狀態(tài)(P=0.033，RR:5.033,95%CI:1.140～22.224)及XPO5 rs11077基因型(P=0.045，RR:0.307,95%CI:0.096～0.976)為3年OS的獨立預(yù)后因素。

表3 基因分型與生存的關(guān)系/%

3 討論

人類miRNA的生物合成分為兩個階段。首先，編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄出初級miRNA(pri-miRNA)；pri-miRNA在細胞核中被RNaseIIIDROSHA切割成60～70個核苷酸的前體miRNA(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA借助RAN-GTPase(RAN)依賴性Exportin-5(XPO5)從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，由RNaseIIIDICER進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RISC，RNA-induced silencing complex)，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制[11]。遺傳變異是影響基因表達或功能的重要作用機制，miRNA合成相關(guān)基因的遺傳變異可導(dǎo)致miRNA合成相關(guān)蛋白表達的異常，從整體水平影響miRNA的表達和功能，影響多種腫瘤的發(fā)生及預(yù)后[12]。

已有研究證實rs11077基因多態(tài)與我國小細胞肺癌[13]、非小細胞肺癌[14]及肝癌[15]等惡性腫瘤患者預(yù)后相關(guān)。Guo等[13]對42例小細胞肺癌患者檢測rs11077基因型，發(fā)現(xiàn)攜帶AA基因型患者的生存期明顯長于攜帶AC+CC基因型者(P=0.023)，rs11077基因型是獨立預(yù)后因素。Ding等[14]在接受鉑類藥物治療的112例非小細胞肺癌患者中分析了rs11077與患者療效及生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AC基因型患者化療療效優(yōu)于AA基因型患者，AC基因型患者的生存期長于AA基因型患者。Liu等[15]在肝細胞癌患者中分析了miRNA生物合成相關(guān)基因多態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs11077 AA基因型患者的生存差于AC及CC基因型患者。

XPO5 rs11077影響惡性腫瘤患者生存的機制還不明了。在結(jié)腸癌細胞株中[16]，XPO5突變及失活可導(dǎo)致miRNA生物合成減少及miRNA靶向抑制的降低，而復(fù)活XPO5則可恢復(fù)miRNA由細胞核至細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運并起到抑制腫瘤的作用。rs11077多態(tài)位于XPO5基因的3’非編碼區(qū)(3’UTR)，可能影響XPO5的表達水平，進而影響腫瘤患者的生存期。由于在不同研究中，基因型與預(yù)后的關(guān)系有所不同，一些學者認為在不同類型的腫瘤細胞中，SNP對miRNA的調(diào)節(jié)作用可能有所不同[15]。

目前尚未見miRNA生物合成相關(guān)基因多態(tài)與胃癌預(yù)后的相關(guān)研究。我國學者[17]曾對XPO5 rs11077、RAN rs14035、DICER rs3742330、TNRC6B rs9623117、GEMIN3 rs197412以及GEMIN4 rs2740348與胃癌易感性的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)攜帶RAN rs14035 CC基因型、DICER rs3742330 AA基因型、TNRC6B rs9623117 TT基因型者胃癌發(fā)生風險高。我們在接受奧沙利鉑及氟尿嘧啶類藥物輔助治療的胃癌患者中，對miRNA生物合成相關(guān)基因的SNP進行研究，發(fā)現(xiàn)XPO5 rs11077 基因型與胃癌患者預(yù)后相關(guān)，攜帶AC基因型的患者預(yù)后更差。本研究中無1例患者為CC基因型，與文獻報道的中國人群中CC基因型少于1%一致[13-15]。

本研究中，DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs2257082基因型與胃癌患者生存均無明顯相關(guān)性。也有學者對這些基因多態(tài)與淋巴瘤[18]及肝細胞癌[19]患者生存的關(guān)系進行了研究，結(jié)果也不一致。DICER rs13078與肝癌患者生存無關(guān)，DICER rs3742330與肝癌及T細胞淋巴瘤生存相關(guān)，RAN rs14035與肝癌患者預(yù)后相關(guān)但與非霍奇金淋巴瘤生存無關(guān)。由于本研究及上述研究病例數(shù)均有限，還需擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，本研究顯示XPO5 rs11077 基因型與接受奧沙利鉑及氟尿嘧啶類藥物輔助化療的非轉(zhuǎn)移性胃癌患者預(yù)后相關(guān)，是獨立的預(yù)后因素，攜帶AC基因型的患者預(yù)后更差。本研究納入的病例數(shù)及檢測位點有限，為了進一步驗證本研究的結(jié)果，更好的闡明miRNA生物合成相關(guān)SNP在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，還需要擴大樣本量，增加檢測位點，進行更為深入的機制研究。

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