徐國(guó)萍 王 杰 楊 莉 何 奇

三陰性乳腺癌是1種具有較強(qiáng)臨床侵襲性表現(xiàn)的乳腺癌，是為雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)以及人體表皮生長(zhǎng)因子受體2(CerbB-2)免疫組化標(biāo)記均為陰性的1種特殊類型乳腺癌[1]，約占乳腺癌的15%。從目前來(lái)看臨床治療上因缺乏針對(duì)三陰性乳腺癌的靶向藥物而導(dǎo)致治療效果的不佳以及傳統(tǒng)預(yù)后指標(biāo)的不明確使乳腺癌預(yù)后不良的案例屢見不鮮，所以找出對(duì)三陰性乳腺癌敏感，并且對(duì)其預(yù)后有重要參考價(jià)值的生物分子指標(biāo)顯得非常重要。故本文針對(duì)三陰性乳腺癌的分子生物學(xué)特征進(jìn)行深入探討作為判斷腫瘤預(yù)后以及尋找靶點(diǎn)便于臨床治療有著一定的臨床指導(dǎo)意義。本文采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin-biotin-peroxidsae complex method,SABC)檢測(cè)186例三陰性乳腺癌患者病理組織中TopoⅡα的表達(dá)，并綜合患者的年齡、腫瘤大小和病理類型、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況展開深入的分析和討論。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2016年12月我院收治的186例經(jīng)病理證實(shí)的女性三陰性乳腺癌患者。年齡≥60歲的43例，<60歲的143例，中位年齡69歲。其中腫瘤直徑>5 cm者9例，≤2 cm者101例，>2 cm且≤5 cm者76例。病理組織學(xué)類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌165例，導(dǎo)管原位癌21例。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者123例，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者63例。TNM分期：Ⅰ期72例，Ⅱ期92例，Ⅲ期22例。組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)72例，Ⅲ級(jí)102例。所有患者均進(jìn)行常規(guī)胸片以及腹腔B超，并確定腫瘤分期和排除其他腫瘤的可能。經(jīng)過穿刺活檢以及外科手術(shù)的方式采集三陰性乳腺癌的組織標(biāo)本，并應(yīng)用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，DAB顯色。另選擇40例乳腺增生患者以及40例導(dǎo)管上皮不典型增生患者為良性對(duì)照。

1.2 主要試劑

鼠抗人TopoⅡα單克隆抗體及其相關(guān)試劑主要購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司。

1.3 方法

采用SABC免疫組化法[2]。先將組織切片用EDTA修復(fù)液抗原，緩沖液切片PBS沖洗。于標(biāo)本上滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。滴加Ⅰ抗(鼠抗人TopoⅡα單克隆抗體)，4 ℃放置24 h。生物素化二抗(羊抗兔IgG)滴加切片。切片上滴加SABC，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色，蒸餾水沖洗。再使用蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化。酒精脫水，用二甲苯透明、樹膠封片。用正常的PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)人員按照試劑盒要求嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.4 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

所有標(biāo)本切片染色后均由研究者和病理科醫(yī)生通過雙盲法讀片。每例切片在光鏡下選取5高倍鏡視野進(jìn)行結(jié)果判定，免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)為出現(xiàn)棕褐色顆粒并參照二級(jí)計(jì)分法：①按照陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；②按照染色深淺：無(wú)染色為0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色為3分。兩者得分乘積≥4～6分為陽(yáng)性表達(dá)，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，<4分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TopoⅡα在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況

TopⅡα主要定位于細(xì)胞核染成棕黃色。186例三陰性乳腺癌組織中TopoⅡα陽(yáng)性率表達(dá)率為70.9%(132/186)，與40例乳腺增生組織中TopoⅡα陽(yáng)性率表達(dá)[27.5%(11/40)]以及40例導(dǎo)管上皮不典型增生組織中TopoⅡα陽(yáng)性表達(dá)率[22.5%(9/40)]相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在165例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中TopoⅡα陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)有122(73.9%)例，與在21例導(dǎo)管原位癌[10例(47.6%)]相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TopoⅡα表達(dá)在乳腺增生組織轉(zhuǎn)變?yōu)槿幮匀橄侔┮约叭橄侔┌l(fā)生發(fā)展的過程中水平不斷提高，TopoⅡα可能與乳腺增生組織的惡性轉(zhuǎn)變有關(guān),見表1。

表1 TopoⅡα在乳腺疾病組織中的表達(dá)情況/例

2.2 TopoⅡα表達(dá)與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

三陰性乳腺癌中TopoⅡα表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、TNM臨床分期均無(wú)關(guān)(P>0.05)，TopoⅡα表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，TopoⅡα陽(yáng)性表達(dá)率在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中高達(dá)80.9%，在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中僅有49.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[3]，約占所有惡性腫瘤的23%。其中三陰性乳腺癌約占所有乳腺癌病理類型的15%左右，具有組織學(xué)分級(jí)高、病理類型幾乎均為導(dǎo)管癌、腫瘤細(xì)胞多表達(dá)等特點(diǎn)，由于其雌、孕激素受體均為陰性，使其無(wú)法從較為成熟的乳腺癌內(nèi)分泌治療以及靶向治療中收益，使得在臨床治療中濫用化療藥物給患者帶來(lái)不良的預(yù)后以及經(jīng)濟(jì)方面的困難，因此對(duì)這一群體的研究顯得非常重要和迫在眉睫。故本文從蛋白質(zhì)的角度來(lái)選擇癌癥發(fā)生發(fā)展中的特異性指標(biāo)TopoⅡα來(lái)研究希望可以為臨床治療提供有效的信息。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo)主要存在于真核及原核細(xì)胞中并參DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[4]。TopoⅡ又稱旋轉(zhuǎn)酶，具有α和β兩種同工酶，TopoⅡα位于增殖細(xì)胞中，通過在DNA的復(fù)制過程中，使其形成1個(gè)雙鏈缺口從而使得雙鏈DNA與斷裂的DNA通過此缺口來(lái)進(jìn)行重新連接使得下一步解鏈復(fù)制得以進(jìn)行，TopoⅡα蛋白在細(xì)胞分裂時(shí) DNA 轉(zhuǎn)錄、重組、復(fù)制，染色體固縮和分離及染色體結(jié)構(gòu)的保持上起重要作用[5]。Bria等[6]發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα的表達(dá)具有周期特異性，在細(xì)胞周期S期-G2/M期TopoⅡα含量快速上升，有絲分裂后(G1、G0期)下降，TopoⅡα蛋白陽(yáng)性提示腫瘤細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。TopoⅡα 的蛋白編碼位于人染色體17q12-21這一區(qū)域內(nèi)，這意味著無(wú)論TopoⅡα擴(kuò)增或缺失都預(yù)示著不良的預(yù)后。也有研究表明，TopoⅡα在乳腺癌組織的表達(dá)與預(yù)后指標(biāo)存在一定的關(guān)系[7]。在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出從乳腺增生組織發(fā)展成原位癌再進(jìn)一步成為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的過程中，TopoⅡα的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，染色程度有黃色發(fā)展成棕褐色，在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中也發(fā)現(xiàn)了TopoⅡα的陽(yáng)性表達(dá)增高。這進(jìn)一步說TopoⅡα的表達(dá)使得細(xì)胞復(fù)制加快并隨著腫瘤的不斷增殖，惡性程度的不斷提高而升高。這可以從正面反映TopoⅡα可以預(yù)示腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的關(guān)系。在目前三陰性乳腺癌的臨床治療中，將蒽環(huán)類和紫杉醇類藥物納入輔助化療方案已經(jīng)基本達(dá)成共識(shí)。蒽環(huán)類藥物的作用機(jī)制是抑制TopoⅡα,通過與TopoⅡαDNA復(fù)合體相互作用,導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂隨后發(fā)生細(xì)胞凋亡[8]。然而,蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤過程中膜脂過氧化導(dǎo)致自由基形成,具有心臟毒性。所以,應(yīng)用蒽環(huán)類藥物治療乳腺癌之前,要權(quán)衡預(yù)期的療效和副作用,選擇可能最大受益的個(gè)體,有鑒于此,需深入研究TopoⅡα的基因狀況而TopoⅡα為蒽環(huán)類抗生素的作用靶點(diǎn)，腫瘤內(nèi)TopoⅡα表達(dá)能直接影響到化療的整體療效水平，這點(diǎn)與韓艷春等[9]的研究觀點(diǎn)一致。是否在聯(lián)合化療中添加TopoⅡα抑制劑來(lái)提高腫瘤對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性以獲得更好的療效和預(yù)后使得TopoⅡα的檢測(cè)在臨床治療的過程中變得至關(guān)重要，也在用藥方面提出了指導(dǎo)性意見，值得進(jìn)一步推廣和深入的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，研究TopoⅡα在三陰性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的病理指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα在發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.9%顯著高于未發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的陽(yáng)性表達(dá)率49.6%，但與患者的年齡大小，腫瘤的組織學(xué)分級(jí)以及TNM分期無(wú)關(guān)。這證明了TopoⅡα的高表達(dá)率能提示腫瘤出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，能為腫瘤惡性程度以及出現(xiàn)轉(zhuǎn)移做出預(yù)示和評(píng)價(jià)。也有研究表明TopoⅡα高表達(dá)也可能與腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。另外據(jù)報(bào)道，在TopoⅡα陽(yáng)性表達(dá)高度時(shí)，患者采用單一藥物阿霉素進(jìn)行治療，其癥狀緩解程度相對(duì)較高，體內(nèi)TopoⅡα高度表達(dá)的乳腺癌患者依然可以通過蒽環(huán)類抗腫瘤藥物取得顯著的療效[11]。

表2 浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TopoⅡα表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系/例

不僅僅在三陰性乳腺癌中,李晶等人發(fā)現(xiàn)TopoⅡα陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，脈管內(nèi)癌栓有顯著的相關(guān)性[12]；屈王蕾等發(fā)現(xiàn)TopoⅡα表達(dá)隨著宮頸癌前病變的嚴(yán)重程度而上調(diào)，可能參與宮頸上皮的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)變[13]。

綜上所述，TopoⅡα的高度表達(dá)患者腫瘤惡性程度高，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性高，檢測(cè)TopoⅡα可以為預(yù)后提供評(píng)價(jià)。免疫組化法易于檢測(cè)TopoⅡα可為患者制定個(gè)體化化療方案以及用藥指導(dǎo)提供可靠的依據(jù)。TopoⅡα可作為化療用藥選擇的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)。TopoⅡα在胃癌、宮頸癌等其他癌癥中也有表達(dá)，TopoⅡα值得研究人員和學(xué)者們進(jìn)行更加深入的研究和學(xué)習(xí)。

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