吳 芳 陳鳳舞 劉方文 紀(jì) 巧 王小慧 郭 妮

目前抗血管內(nèi)皮生成藥物——恩度，廣泛用于臨床，并取得較好療效。外周血中測(cè)得的血管內(nèi)皮細(xì)胞-循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cells，0CECs)，可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成且能較好的反應(yīng)腫瘤患者體內(nèi)血管生成的狀態(tài)，可能是1個(gè)與預(yù)后密切相關(guān)的靈敏檢測(cè)指標(biāo)。許多研究表明，CECs是1個(gè)很好的抗血管生成療效指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c裸鼠32只,4～5周齡,雌性,體重16～18 g,購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究所。人肺腺癌A549細(xì)胞由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究所惠贈(zèng)。恩度15 mg/支，先聲藥業(yè)惠贈(zèng)，批號(hào):S20050088。紫杉醇，60 mg/支，黃石李時(shí)珍藥業(yè)集團(tuán)惠贈(zèng)，批號(hào)H20058368。美國(guó)Beckman-Coulter 公司流式細(xì)胞儀(型號(hào):EPICS-XL IIMCL，科大創(chuàng)新公司 KDC-6000R 低速冷凍離心機(jī)，分析系統(tǒng)軟件System II)?？贵w:大鼠抗裸鼠CD45-PE (CHEMICON公司)。大鼠抗裸鼠CD146-FITC (CHEMICON公司)。同型對(duì)照:大鼠FITC-IgG2a(CHEMICON公司)，大鼠IgG2b-PE(CHEMICON公司)，紅細(xì)胞裂解液及流式液購(gòu)自美國(guó)Beckmancoutler公司。

1.2 方法

1.2.1 建立人肺腺癌A549細(xì)胞系動(dòng)物模型 制備瘤源鼠動(dòng)物模型:在RPMI-1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)解凍的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，1周后采集細(xì)胞，制成濃度約 5×107個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于裸鼠的雙側(cè)鼠蹊部，每側(cè)注射 200 μl。制備荷瘤實(shí)驗(yàn)鼠：BALB/c裸鼠32只隨機(jī)分成4組,每組8只：同時(shí)給藥組，先恩度給藥組，模型組和空白對(duì)照組。將制備好的瘤塊接種于裸鼠的鼠蹊部,接種3組,共24只，空白對(duì)照組8只不接種瘤塊。

1.2.2 給藥方法 使用注射用水配制恩度注射液，皮下注射；使用生理鹽水配制紫杉醇注射液，腹腔注射。

同時(shí)給藥組:恩度，每天300 μg/只，d1～d35，紫杉醇，30 mg/kg/3天，d1～d19，給藥第35天處死。先恩度給藥組:恩度，每天300 μg/只，d1～d35;紫杉醇，30 mg/kg/3天，d16～d34。給藥第35天處死。模型組：生理鹽水，每天100 μl/只，皮下注射，d1、d35；注射用水，300 μl/只/3天，腹腔注射，d1、d35。第35天處死?？瞻捉M：給藥同模型組。

1.2.3 采血及處死 給藥完畢后1天，摘眼球取血。隨后以脫頸椎法處死裸鼠。完整剝離瘤組織。

1.2.4 繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑瘤率 每周稱裸鼠體重2次。每周測(cè)量加藥后瘤塊的長(zhǎng)徑a及短徑b 2次，按公式(瘤體積V=a×b2/2)計(jì)算移植瘤體積，計(jì)算每組平均值，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。計(jì)算抑瘤率=(1-治療組體積/對(duì)照組體積 )× 100%。

1.2.5 FCM(流式細(xì)胞術(shù))檢測(cè)裸鼠血中aCECs水平 ①取2支流式細(xì)胞檢測(cè)管，分別標(biāo)記為對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)管，每管加入裸鼠靜脈血100 μl。②對(duì)照管加入FITC及PE標(biāo)記的Ig同型對(duì)照各1 μl;實(shí)驗(yàn)管加入CD45-PE及大鼠CD146-FITC。振蕩混勻，常溫避光孵育30分鐘。③每管加入紅細(xì)胞裂解液0.5 ml，混勻，避光孵育15 min;滴加流式液至5 ml并混勻，離心5 min(1500轉(zhuǎn)/分鐘);除去上清液，加入流式液0.5 ml，振蕩混勻，上機(jī)檢測(cè)。④上機(jī)前以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2以內(nèi)，以目標(biāo)細(xì)胞群設(shè)門(mén)，上機(jī)后收集1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞發(fā)出的熒光測(cè)定表達(dá)率并計(jì)算CD45-CD146+細(xì)胞(aCECs)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(肘)及四分位數(shù)間距(Q)表示，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠治療前后腫瘤體積比較

同時(shí)用藥組和先恩度組治療前后腫瘤體積的差值均低于模型組(P<0.05)，但同時(shí)用藥組腫瘤增長(zhǎng)較慢，與先恩度組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05) (圖1，表1)。

圖1 各組腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.2 各組裸鼠外周血中CECs數(shù)量的比較

同時(shí)用藥組、先恩度組、模型組和空白對(duì)照組裸小鼠外周血中CECs的數(shù)量分別為(25.86±11.77)個(gè)/104個(gè)細(xì)胞、(77.25±24.02) 個(gè)/104個(gè)細(xì)胞、(14.71±11.07) 個(gè)/104個(gè)細(xì)胞和(12.90±11.20) 個(gè)/104個(gè)細(xì)胞，同時(shí)用藥組、模型組和空白對(duì)照組均明顯低于先恩度組(P均<0.01)，而同時(shí)用藥組、模型組和空白對(duì)照組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

3 討論

我國(guó)自主研發(fā)人重組血管內(nèi)皮抑素——恩度，與化療聯(lián)合取得較好的抗腫瘤治療效果。但與化療聯(lián)合的時(shí)序問(wèn)題目前尚無(wú)定論。但也有學(xué)者認(rèn)為，血管正常化只是1個(gè)短暫過(guò)程，產(chǎn)生的療效較小，先使用化療藥物大量殺傷腫瘤后，再行抗血管生成治療才能使患者得到最大獲益。因此，比較恩度聯(lián)合化療不同給藥時(shí)序的療效，為臨床制定最佳治療方案提供依據(jù)。

目前抗血管生成類藥物的療效評(píng)價(jià)尚無(wú)明確的生物標(biāo)志物，評(píng)價(jià)抗血管生成治療藥物療效的方法包括內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(如微血管密度)、腫瘤血管超微結(jié)構(gòu)的觀察[1]、血管生成調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)[2]、彩色多普勒測(cè)定血流、間接觀察腫瘤大小或腫瘤標(biāo)志的監(jiān)測(cè)及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞CECs檢測(cè)，其中CECs檢測(cè)因取材方便、操作簡(jiǎn)易且可動(dòng)態(tài)觀察其含量變化而成為首選評(píng)價(jià)療效方法[3]。大量文獻(xiàn)表明CECs可作為腫瘤的生物標(biāo)記物，其含量與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[4]，癌癥患者外周血中的CEC含量高于正常人，完全緩解后降至正常[5]。在進(jìn)展期腫瘤患者中富含活化的CEC，通過(guò)促進(jìn)新生血管生成從而影響腫瘤的演變及轉(zhuǎn)移[6-7]。

表1 第35天各組體積及抑瘤率(±s)

表1 第35天各組體積及抑瘤率(±s)

組別例數(shù)瘤體積/mm3療前療后差值/mm3P抑瘤率/%同時(shí)組88．56±4．5444．88±35．1236．32±30．580．020▲80先恩度組86．42±2．44118．88±74．22112．46±71．780．010△48模型組86．68±2．56221．52±96．13214．84±93．570．002?

注：▲為同時(shí)組與先恩度組差值的比較，△為先恩度組與模型組比較，*為模型組與同時(shí)組比較。

圖2 各組裸鼠中CECs數(shù)量比較

本研究，比較了恩度與紫杉醇不同給藥順序的抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)也探討了不同給藥時(shí)序，CECs數(shù)量的變化。在抑瘤率方面，同時(shí)用藥組優(yōu)于先恩度組，(80% vs 48%P<0.05),與袁靜等[8]報(bào)道一致?？紤]化療后腫瘤負(fù)荷減輕，腫瘤細(xì)胞同步化進(jìn)入處于G0/G1期，隨后恩度作用于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。在CECs數(shù)量方面，同時(shí)用藥組和先恩度組較模型組CECs數(shù)量明顯減少，同時(shí)用藥組的CECs數(shù)量最少，但與先恩度組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，在化療聯(lián)合恩度治療非小細(xì)胞肺癌有效的患者中，其aCECs水平呈下降趨勢(shì)。國(guó)外類似研究的結(jié)果也顯示，非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療后，aCECs數(shù)量下降[10]。化療藥物的腫瘤殺傷作用強(qiáng)，可迅速減少促血管生成因子(tumor angiogenesis factors，TAFs)，誘導(dǎo)CECs產(chǎn)生凋亡，恩度可以維持此作用，故CECs數(shù)量明顯降低。

綜上，化療聯(lián)合恩度，同時(shí)應(yīng)用化療與恩度，待有效削減腫瘤體積后，再以抗血管生成藥物維持治療。治療后CECs數(shù)量下降則反映了CECs的凋亡和腫瘤消退，其變化可能可以幫助預(yù)測(cè)療效。

[1] Brandwi jk RJ，Dings RP，van der Linden E et al.Antiangiogenesis and antitumor activity of recombinant anginex〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006，349(3)：1073-1078.

[2] Dudek Az,Mahaseth n.Circulating angiogenic cytokines in patients with advanced non-small cell lung cancer：correlation with treatment response and survival〔J〕.Cancer Invest，2005，23(3)：193-200.

[3] Goon PK，Lip GY，Boos CJ，et al.Circulating endothelial cells，endothelial progenitor cells，and endothelial micropart icles in cancer〔J〕.Neoplasia,2006，8(2)：79-88.

[4] Natori T，Sata M，Washida M，et al.G-CSF stimulates angiogenesis and promotes tumor growth：potential contribution of bone marrow-derived endothelial progenitor cel ls〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002，297(4)：1058-1061.

[5] Beerepoot LV，Mehra N，Vermaat js，et al.Increased levels of viable circulating endothelial cells are an indicator of progressive disease in cancer patients〔J〕.Ann Oncol，2004，15(1):139-145.

[6] Bertolini F，Mancuso P，Braidotti P，et al.The multiple personality disorder phenotype(s)of circulating endothelial celIs in cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009，1796(1)：27-32.

[7] Pluda JM.Tumor-assoc iated angiogenesis：mechani sins，c l inical impl icat ions，and therapeut ic strategies〔J〕.Semin Oncol，1997，24(2)：203-218.

[8] 袁 靜，吳春娃，劉竹君,等.重組血管內(nèi)皮抑素注射液與多西他賽不同順序用藥的抗腫瘤效應(yīng)觀察〔J〕.中華腫瘤雜志，2010，32(8)：580-585.

[9] Wang J，thang C，Wei XY，et al.changes of activated eireulaling endothelial cells and surviving in patients with non-small cell lung cancer after antiangiogenesis therapy〔J〕.Chin Med J，2008,121(22)：2334-2340.

[10] Kamaishi M，F(xiàn)ujwara Y，F(xiàn)ukui T，et al.Circulating endothelial cells in non-small cell lung cancer patients treated with carboplatin and paclitaxel〔J〕.J Thorac Oncol,2009,4(2)：208-213.