劉 丹，侯力丹 ，李啟紅，黃小潔，李俊平，楊承槐

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

獸用疫苗的安全性一直是企業(yè)、養(yǎng)殖戶和監(jiān)管部門非常重視的問題。由于疫苗的生產(chǎn)原材料如組織、細(xì)胞、血清等大多來(lái)源于動(dòng)物，因此疫苗產(chǎn)品存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。污染了外源病毒的疫苗不僅不能預(yù)防和控制疾病，反而造成疾病爆發(fā)和擴(kuò)散，對(duì)人和養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，所以實(shí)施系統(tǒng)性的檢測(cè)和采取嚴(yán)格的預(yù)防措施可以有效降低外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來(lái)發(fā)生的禽用活毒疫苗污染事件，以禽白血病病毒(Avian leucosis virus，ALV)[4-5]、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)[6-7]和雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CAV)[8-9]較為常見。如果禽用活疫苗混有ALV、REV和CAV等外源病毒，在使用污染的疫苗時(shí)會(huì)加劇該疫病的傳播，并且這些疾病可引起免疫抑制、免疫失敗或直接導(dǎo)致免疫動(dòng)物發(fā)病，影響正常疫苗免疫效果[10]。

進(jìn)行禽用活疫苗外源病毒污染的檢驗(yàn)，對(duì)確保疫苗質(zhì)量和產(chǎn)品安全方面具有重要作用。為對(duì)禽用活疫苗污染外源病毒的情況進(jìn)行摸底調(diào)查，試驗(yàn)抽取了18家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、7家國(guó)外企業(yè)生產(chǎn)的禽用活疫苗重點(diǎn)品種，按照《中國(guó)獸藥典》 2010年版三部外源病毒檢驗(yàn)[11]雞檢查法和《禽病活疫苗禽腺病毒污染摸底調(diào)查工作方案》對(duì)抽檢的禽病活疫苗進(jìn)行了外源病毒污染和禽腺病毒(Group I adenovirus，F(xiàn)AdV-I)污染檢驗(yàn)，為更好監(jiān)控疫苗安全性提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 共抽檢禽用活疫苗8種28批(表1)。

表1 國(guó)內(nèi)外企業(yè)抽檢的疫苗Tab 1 Vaccines of domestic and foreign enterprises

1.1.2 主要試劑 雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ReoV)、雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease virus，IBDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、禽白血病病毒(A、B亞群和J亞群)、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus，AEV )、雞傳染性貧血病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自IDEXX公司；雞傳染性喉氣管炎病毒(Avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒、FAdV-I抗體檢測(cè)試劑盒為Biocheck公司產(chǎn)品；禽A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)(H5、H9亞型)、雞新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)的血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI )試驗(yàn)抗原和陽(yáng)性血清、FAdV-I和雞馬立克氏病病毒( Marek's disease virus，MDV)的瓊擴(kuò)抗原和陽(yáng)性血清、雞陰性血清均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室保存。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 自山東斯帕法斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)入25日齡SPF雞350只，隔離器中飼養(yǎng)備用。

1.2.2 首免 按照各批疫苗瓶簽注明的羽份，每批疫苗至少抽取2瓶，均用生理鹽水混合稀釋成100 羽份/ mL，各點(diǎn)眼接種31日齡SPF雞10只，每只0.1 mL(含10羽份)，同時(shí)肌肉注射接種1 mL(含100羽份)，隔離飼養(yǎng)觀察14 d。

1.2.3 二免 按首免方法和劑量重復(fù)接種1次。隔離飼養(yǎng)觀察21 d，記錄是否有因注射引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡情況。

1.2.4 分離血清 觀察到期，每只雞經(jīng)翅靜脈采血1 mL，分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ELISA抗體檢測(cè) 進(jìn)行IBV、REO、IBDV、REV、ALV(A、B亞群和J亞群)、AEV 、CAV、ILTV和FAdV-I等ELISA抗體檢測(cè)，依據(jù)各ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 瓊脂抗體檢測(cè) FAdV-I和MDV抗體用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)，按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.7 HI檢測(cè) AIV(H5、H9亞型)、NDV和EDSV抗體用HI試驗(yàn)檢測(cè)，按常規(guī)方法進(jìn)行。

2 檢驗(yàn)結(jié)果

抽檢的18家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、7家國(guó)外企業(yè)的共28批疫苗，接種SPF雞后，在35 d臨床觀察期內(nèi)均健活；除了本疫苗所產(chǎn)生的特異性抗體外，其他外源病毒抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性；禽腺病毒抗體ELISA抗體和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性，表明抽檢的疫苗均無(wú)外源病毒和禽腺病毒污染，結(jié)果見表2和表3。

表2 外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果(ELISA結(jié)果)Tab 2 The results of extraneous virus test(ELISA)

續(xù)表

雞病毒性關(guān)節(jié)炎活疫苗(S1133株)國(guó)外企業(yè)310/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性

表3 外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果(臨床觀察、HI和AGP結(jié)果) Tab 3 The results of extraneous virus test(Clinical observations, HI, and AGP)

雞傳染性法氏囊病復(fù)合凍干活疫苗(2512株)國(guó)外企業(yè)310/10健活10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性

續(xù)表

3 討 論

疫苗的預(yù)防接種是目前有效控制家禽疫病的重要手段之一，但由于病毒類制品在毒種選育和生產(chǎn)過程中經(jīng)常使用動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)，因此有可能造成外源病毒的污染。常見的外源病毒污染有REV、ALV和CAV等，這些病毒的共同特點(diǎn)是：既可以水平傳播，也可以垂直傳播，感染后能引起免疫抑制，沒有相應(yīng)的疫苗防控。 因此，一旦雞群感染這些病原，將會(huì)引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，需要對(duì)毒種、細(xì)胞和成品進(jìn)行外源病毒的檢測(cè)，我國(guó)常用的外源病毒檢驗(yàn)方法有雞胚檢查法、細(xì)胞檢查法和雞檢查法。雞檢查法一般不用，只在用雞胚檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)無(wú)結(jié)果或可疑時(shí)，用雞進(jìn)行檢驗(yàn)[11-13]。

除了上述常見的外源病毒污染外，近年來(lái)I群禽腺病毒(FAdV-1)疫情爆發(fā)，受到農(nóng)業(yè)部高度重視，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局下發(fā)了《關(guān)于開展禽病活疫苗腺病毒污染摸底調(diào)查的函》(農(nóng)醫(yī)藥便[2016]87號(hào))，中監(jiān)所組織相關(guān)技術(shù)專家制定了禽腺病毒摸底調(diào)查方案。我們查閱比較了國(guó)內(nèi)外有關(guān)禽病活疫苗禽腺病毒污染控制的方法，發(fā)現(xiàn)我國(guó)、美國(guó)及歐洲對(duì)禽病活疫苗成品進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)時(shí)均無(wú)專門針對(duì)I群FAdV檢驗(yàn)的方法，《歐洲藥典》對(duì)基礎(chǔ)種毒的外源病毒檢驗(yàn)需用雞檢查法，該方法規(guī)定需對(duì)I群FAdV進(jìn)行檢測(cè)。而我國(guó)對(duì)基礎(chǔ)種毒外源病毒的檢驗(yàn)未強(qiáng)制使用雞檢查法，且我國(guó)目前的雞檢查法中也沒有對(duì)I群FAdV檢測(cè)的要求。

《禽病活疫苗禽腺病毒污染摸底調(diào)查工作方案》中的檢驗(yàn)方法，是借鑒《歐洲藥典》2.6.24"6.Test For Extraneous Agents Using Chicks"。即：取2～5周齡的SPF雞10只，點(diǎn)眼接種10羽份疫苗，肌肉注射100羽份疫苗，2周后，按上述方法和劑量重復(fù)接種1次。接種后每天觀察SPF雞狀態(tài)。第2次接種后21日采血，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法、ELISA方法或間接免疫熒光方法檢測(cè)I群FAdV抗體。在接到農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局開展禽病活疫苗腺病毒污染摸底調(diào)查的任務(wù)后，制定方案、抽檢疫苗、進(jìn)行禽腺病毒污染檢驗(yàn)，同時(shí)對(duì)所有的疫苗進(jìn)行了其他外源病毒抗體的檢測(cè)。試驗(yàn)用的試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量和免疫程序，雖與《中國(guó)獸藥典》2010年版三部雞檢查法不一致，但由于該方法與《歐洲藥典》雞檢查法一致，所以試驗(yàn)的外源病毒檢測(cè)結(jié)果是有效和具有說(shuō)服力的[14]。

試驗(yàn)抽取了18家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、7家國(guó)外企業(yè)生產(chǎn)的禽用活疫苗重點(diǎn)品種，結(jié)果顯示所抽檢的禽用活疫苗均無(wú)外源病毒污染和禽腺病毒污染，表明我國(guó)禽用活疫苗的質(zhì)量控制和安全性良好，這是企業(yè)、養(yǎng)殖戶和監(jiān)管部門共同努力的結(jié)果。為了保證生物制品安全，所有起始材料和最終產(chǎn)品都必須檢測(cè)潛在污染物。盡管如此，污染風(fēng)險(xiǎn)還不能完全排除，只是盡可能降低。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)因子并沒有具體規(guī)定和檢測(cè)方法，應(yīng)該采取什么措施才能最大程度地提高安全性值得考慮[15]。對(duì)于I群FAdV，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室也正在建立其污染禽用活疫苗的相關(guān)檢驗(yàn)方法，以期納入新版獸藥典，規(guī)范禽病毒類生物制品外源病毒檢驗(yàn)。

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