李厚偉，孫林杰，孫永珍，曹艷杰，徐 進(jìn),3*>

(1. 河南后羿生物工程股份有限公司，鄭州 451161；2. 鄭州市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，鄭州 451161；3. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒引起的一種高度接觸傳染性疾病，該病傳播速度快，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90%～100%[1]，主要侵害出殼后3～20日齡幼鵝和番鴨，可感染櫻桃谷鴨、騾鴨、麻鴨等[2]，給世界范圍內(nèi)的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。本病的控制措施主要是使雛鵝在出殼后的4～5周內(nèi)產(chǎn)生足夠的免疫力[4]，目前主要依靠接種減毒活疫苗和滅活疫苗預(yù)防小鵝瘟，但是流行病學(xué)調(diào)查表明鵝細(xì)小病毒常呈潛伏感染并持續(xù)存在[5-6]。通過高免雞蛋提取的小鵝瘟特異性卵黃抗體可以有效的預(yù)防和控制本病發(fā)生[7]。同時(shí)，由于小鵝瘟卵黃抗體具有不激活補(bǔ)體，不結(jié)合類風(fēng)濕因子，可避免補(bǔ)體系統(tǒng)的干擾及檢測假陽性的出現(xiàn)[8-9]，操作簡便，對產(chǎn)蛋率無影響等優(yōu)點(diǎn)，所以小鵝瘟卵黃抗體用于緊急預(yù)防接種具有較大的實(shí)踐意義[10-11]。小鵝瘟凍干卵黃抗體的免疫保護(hù)期是決定小鵝瘟免疫程序的關(guān)鍵因素，為此試驗(yàn)選取不同抗體效價(jià)的小鵝瘟凍干卵黃抗體接種不同日齡的雛鵝，在接種后不同時(shí)間進(jìn)行了攻毒保護(hù)相關(guān)性的研究，以確定不同效價(jià)的小鵝瘟凍干卵黃抗體在雛鵝體內(nèi)的最佳免疫保護(hù)期。

1 材 料

1.1 小鵝瘟凍干卵黃抗體 鄭州市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心制備，試驗(yàn)組A：3批瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16的卵黃抗體(批號為201701、201702、201703)；試驗(yàn)組B：3批瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32的卵黃抗體(批號為201704、201705、201706)；試驗(yàn)組C：3批瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶64的卵黃抗體(批號為201707、201708、201709)；規(guī)格均為50羽份/瓶，2～8 ℃保存，有效期為36個(gè)月。

1.2 檢驗(yàn)用強(qiáng)毒 小鵝瘟病毒W(wǎng)株E2代凍干毒，批號：150701001，病毒含量：每1.0 mL病毒液含104.17LD50，規(guī)格：1.0 mL/支， 由河南后羿生物工程股份有限公司鑒定、保管和供應(yīng)。

1.3 雛鵝 1日齡、4日齡健康易感雛鵝購自商丘柘城縣金忠養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社，試驗(yàn)前對同批雛鵝經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抽樣檢查血清均呈陰性。

1.4 小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原 批號：2016001，由鄭州市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心制備、鑒定、保存及供應(yīng)。

2 方 法

2.1 1日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn) 每批抗體頸部皮下注射1日齡健康易感雛鵝80只，0.5 mL/只，同時(shí)設(shè)同批1日齡健康易感雛鵝80只，每只頸部皮下注射生理鹽水0.5 mL作為攻毒對照；取同批1日齡健康易感雛鵝10只，不注射任何藥品作健康對照。分別于注射抗體后0、12、24、120、144、168、192、216 h，從每批抗體注射鵝中隨機(jī)抽取10只，連同攻毒對照組10只健康易感雛鵝分別注射小鵝瘟強(qiáng)毒W(wǎng)株，每只0.2 mL(含100 LD50)，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10日，記錄雛鵝死亡情況，并依據(jù)下式計(jì)算相對保護(hù)率。相對保護(hù)率=[1-(試驗(yàn)組死亡率/攻毒對照組死亡率)]×100%。

2.2 4日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn) 每批抗體頸部皮下注射4日齡健康易感雛鵝80只，1.0 mL/只，同時(shí)設(shè)同批4日齡健康易感雛鵝80只，每只頸部皮下注射生理鹽水1.0 mL作為攻毒對照；取同批4日齡健康易感雛鵝10只，不注射任何藥品作為健康對照。分別于注射抗體后0、12、24、120、144、168、192、216 h，從每批抗體注射鵝中隨機(jī)抽取10只，連同攻毒對照組10只健康易感雛鵝分別注射小鵝瘟強(qiáng)毒W(wǎng)株，每只0.2 mL(含100 LD50)，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察10日，記錄雛鵝死亡情況，并依據(jù)下式計(jì)算相對保護(hù)率。相對保護(hù)率=[1-(試驗(yàn)組死亡率/攻毒對照組死亡率)]×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 1日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn)結(jié)果 1日齡健康易感雛鵝注射不同效價(jià)的卵黃抗體后，在8個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)注射小鵝瘟強(qiáng)毒W(wǎng)株，攻毒后觀察10日，計(jì)算相對保護(hù)率，結(jié)果見表1。

表1 1日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Result of the passive immunological protection period in one-day-old goslings

如圖1所示，不同效價(jià)的卵黃抗體免疫后，在0 h立即攻毒，抗體即可對1日齡雛鵝產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，且保護(hù)率為100%，持續(xù)至144 h相對保護(hù)率仍為100%；但是抗體注射168 h后再攻毒，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16的試驗(yàn)組出現(xiàn)雛鵝死亡情況，且192 h和216 h攻毒，不同瓊擴(kuò)效價(jià)的試驗(yàn)組均有雛鵝死亡情況。由此可見，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16，對1日齡雛鵝的確實(shí)保護(hù)期至少為6日，且抗體效價(jià)越高，保護(hù)效果越好，攻毒保護(hù)率與卵黃抗體效價(jià)呈正相關(guān)。

3.2 4日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn)結(jié)果 4日齡健康易感雛鵝注射不同瓊擴(kuò)效價(jià)的卵黃抗體后，在8個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)注射小鵝瘟強(qiáng)毒W(wǎng)株，攻毒后觀察10日，計(jì)算相對保護(hù)率，具體結(jié)果見表2。

如圖2所示，在免疫不同瓊擴(kuò)效價(jià)的卵黃抗體后，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，在0 h抗體對4日齡雛鵝即可產(chǎn)生100%的保護(hù)作用，這種保護(hù)效果可持續(xù)至144 h，但是卵黃抗體作為異源蛋白在雛鵝體內(nèi)隨著時(shí)間延長而逐漸消失，從注射抗體168 h開始的攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16試驗(yàn)組出現(xiàn)雛鵝死亡情況，至216 h各試驗(yàn)組雛鵝均出現(xiàn)不同程度的死亡情況。由此可見，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16時(shí)，對4日齡雛鵝免疫保護(hù)期至少6日，且攻毒保護(hù)率與卵黃抗體效價(jià)具有正相關(guān)性。

圖1 1日齡雛鵝各組的平均免疫保護(hù)效率與免疫后接種小鵝瘟病毒時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)性Fig 1 The correlation between the average immunization efficiency and the time points of after inoculation with the gosling virus in every group of one-day-old goslings

表2 4日齡雛鵝被動免疫保護(hù)期試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Result of the passive immunological protection period in four-day-old goslings

圖2 4日齡雛鵝各組的平均免疫保護(hù)效率與免疫后接種小鵝瘟病毒時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)性Fig 2 The correlation between the average immunization efficiency and the time points of after inoculation with the gosling virus in every group of four-day-old goslings

3.3 不同日齡雛鵝被動免疫持續(xù)時(shí)間結(jié)果統(tǒng)計(jì) 1日齡、4日齡健康易感雛鵝注射3種不同瓊擴(kuò)效價(jià)的小鵝瘟凍干卵黃抗體后，分8個(gè)時(shí)間點(diǎn)攻擊小鵝瘟強(qiáng)毒株，攻毒后觀察10日，由表1、表2可知，小鵝瘟凍干卵黃抗體對雛鵝產(chǎn)生100%保護(hù)的保護(hù)期至少可持續(xù)144 h，對不同日齡的雛鵝自144 h后的被動免疫的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3。

可以看出，攻毒對照組雛鵝死亡90%以上，健康對照組雛鵝100%健活，試驗(yàn)組A在注射抗體168 h后進(jìn)行攻毒，對雛鵝的保護(hù)率在93.33%～96.67%之間，仍可提供高效保護(hù)，但在192 h～216 h之間，相對保護(hù)率為55.56%～76.67%，保護(hù)率顯著下降；試驗(yàn)組B在168 h對1日齡及4日齡雛鵝的攻毒保護(hù)率仍為100%，至192 h下降為93.3%，但至216 h對4日齡雛鵝的攻毒保護(hù)率僅為66.67%，已不能確實(shí)保護(hù)健康易感雛鵝；試驗(yàn)組C至192 h對1日齡及4日齡雛鵝的攻毒保護(hù)率仍為100%，至216 h對雛鵝的攻毒保護(hù)率仍在88.89%～93.33%之間，仍可有效抵抗小鵝瘟病毒的侵害。

4 討 論

小鵝瘟是雛鵝的一種高發(fā)致命病，其主要特征為腸栓塞[12]，7日齡以內(nèi)的雛鵝最易感染，日齡越小的雛鵝發(fā)病率越高，且發(fā)病程度也越嚴(yán)重[13]。Zherong You等[14]利用重組的BHc免疫產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)出抗BoNT/B的卵黃抗體，可以中和神經(jīng)毒素的生物學(xué)活性，減少肉毒中毒的風(fēng)險(xiǎn)，研究人員已經(jīng)成功將卵黃抗體應(yīng)用于預(yù)防和治療各種微生物和生物毒素的感染[15]。臧玉婷等[16]利用瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16的小鵝瘟卵黃抗體進(jìn)行的攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，3日齡雛鵝注射抗體后1日攻毒保護(hù)率為100%。試驗(yàn)利用三種不同效價(jià)的卵黃抗體分別免疫不同日齡的雛鵝，在免疫后不同時(shí)間進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，小鵝瘟病毒與卵黃抗體同時(shí)注射，二者可在體內(nèi)發(fā)生中和作用，由于此時(shí)小鵝瘟病毒尚未對組織器官造成實(shí)質(zhì)性的侵害，卵黃抗體可對雛鵝起到保護(hù)作用，攻毒保護(hù)率可達(dá)100%，與臧玉婷等[16]的研究結(jié)果一致。

郭素茵[17]研究卵黃抗體對不同日齡雛鵝感染小鵝瘟的治療結(jié)果表明，卵黃抗體對小鵝瘟的治療效果與日齡呈負(fù)相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，日齡越大，治愈的幾率越低。閆妍[18]采用1.0 mL小鵝瘟精制卵黃抗體治療不同日齡輕度患病雛鵝，結(jié)果表明，1日齡治愈率為97.44%，4日齡治愈率為94.87%，7日齡治愈率為90.48%。利用不同效價(jià)的卵黃抗體分別對1日齡和4日齡雛鵝進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同效價(jià)的卵黃抗體在不同的時(shí)間對1日齡雛鵝相對保護(hù)率均高于對4日齡雛鵝的相對保護(hù)率，其中瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護(hù)率為66.67%，高于對4日齡雛鵝的相對保護(hù)率55.56%，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護(hù)率為76.67%高于對4日齡雛鵝的相對保護(hù)率66.67%，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶64的卵黃抗體在216 h對1日齡雛鵝的相對保護(hù)率為93.33%高于對4日齡雛鵝的相對保護(hù)率88.89%。試驗(yàn)表明，利用卵黃抗體預(yù)防和治療小鵝瘟，日齡越小，越早使用，效果越好。

蘭信海等[19]制備不同瓊擴(kuò)抗體效價(jià)的小鵝瘟卵黃抗體進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)瓊擴(kuò)抗體效價(jià)越高，保護(hù)效果越好。臧玉婷等[20]研究小鵝瘟卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果表明，雛鵝注射相同劑量不同瓊擴(kuò)效價(jià)的卵黃抗體，隨著卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)的升高，對雛鵝的保護(hù)率也隨之升高，抗體效價(jià)的高低與攻毒保護(hù)呈正相關(guān)。試驗(yàn)中，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16的卵黃抗體在144 h的相對保護(hù)率為100%，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32的卵黃抗體免疫保護(hù)期可持續(xù)至168 h，而瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶64的卵黃抗體免疫保護(hù)持續(xù)期可達(dá)192 h，進(jìn)一步驗(yàn)證了卵黃抗體效價(jià)越高，對雛鵝的免疫保護(hù)持續(xù)期越長。但是卵黃抗體屬于異源蛋白，在雛鵝體內(nèi)有一定的消長規(guī)律，而提高瓊擴(kuò)抗體效價(jià)涉及到企業(yè)成本及生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，尋求二者的最佳平衡點(diǎn)，需要進(jìn)一步的研究。

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