趙慶英 張瑞娟 王瑞良 高建華,3 韓淵懷 楊致榮1,,* 王興春,,*

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基于名優(yōu)谷子品種晉谷21全基因組重測(cè)序的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

趙慶英1,**張瑞娟2,**王瑞良2高建華2,3韓淵懷3,4楊致榮1,3,4,*王興春2,3,4,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院, 山西太谷 030801;2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801;3山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所, 山西太谷 030801;4雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西太谷 030801

小米因其營(yíng)養(yǎng)豐富日益受到重視, 而小米的品質(zhì)是民眾選擇小米時(shí)最為關(guān)注的指標(biāo)。晉谷21米質(zhì)優(yōu)異, 但由于缺少基因組信息, 嚴(yán)重阻礙了其優(yōu)異米質(zhì)形成機(jī)制的研究。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù), 對(duì)晉谷21全基因組進(jìn)行重測(cè)序, 獲得了14.95 Gb高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。進(jìn)一步將其與豫谷1號(hào)參考基因組比較, 發(fā)掘了169 037個(gè)InDel位點(diǎn)和1 167 555個(gè)SNP位點(diǎn), 其中長(zhǎng)度在13~50 bp之間適于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的InDel位點(diǎn)為14 578個(gè)。選擇其中1個(gè)SNP位點(diǎn)和68個(gè)InDel位點(diǎn)驗(yàn)證, 表明利用二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的InDel和SNP標(biāo)記真實(shí)可靠?；诿麅?yōu)谷子晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的InDel和SNP分子標(biāo)記具有通用性, 可用于其他谷子、狗尾草和谷莠子等種質(zhì)資源的相關(guān)研究。同時(shí), 開(kāi)發(fā)了一個(gè)晉谷21特異的InDel標(biāo)記2G5501976, 利用該標(biāo)記即可快速鑒定待測(cè)材料是否為晉谷21及其衍生品種。本研究初步揭示了晉谷21的基因組特征, 不僅為深入解析其優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ), 而且為相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種、遺傳分析和基因克隆提供了分子標(biāo)記資源。

谷子; 晉谷21; InDel; SNP; 分子標(biāo)記; 基因組重測(cè)序

谷子(L.)起源于中國(guó), 是我國(guó)過(guò)去幾千年來(lái)的主栽作物和中華民族的哺育作物。脫殼后的谷子稱為小米, 富含蛋白質(zhì)、脂肪、鐵、類胡蘿卜素、纖維素、維生素等[1-3]。近年來(lái), 隨著人們生活水平的不斷提高及食品的多樣化和營(yíng)養(yǎng)化, 優(yōu)質(zhì)小米倍受青睞。然而, 長(zhǎng)期以來(lái)谷子品質(zhì)相關(guān)的研究進(jìn)展緩慢, 且主要集中在外觀品質(zhì)和簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)成分分析方面。中國(guó)作物信息網(wǎng)(http://www. cgris.net/)登記在冊(cè)的谷子種質(zhì)資源中呈現(xiàn)出16種不同的米色, 其中黃色米占77%。小米中的黃色物質(zhì)主要是類胡蘿卜素, 其含量與外觀品質(zhì)顯著相關(guān), 是小米品質(zhì)育種的重要指標(biāo)。黃米中類胡蘿卜素的含量與綠米相當(dāng), 但顯著高于白色品種[4]。王潤(rùn)奇等[5]利用三體分析法將白米和青米基因分別定位于第4和第6染色體, 為米色基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。最近, 我們發(fā)現(xiàn)谷子番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene beta cyclase, LCYB)可能通過(guò)影響β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素在籽粒中的積累, 進(jìn)而影響小米的米色[6]。蒸煮品質(zhì)和食用品質(zhì)是小米品質(zhì)構(gòu)成的最重要方面, 主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量及比例決定。直鏈淀粉含量較低的小米米飯柔軟且口感好, 相反, 直鏈淀粉含量較高的小米蒸煮后米飯干燥、蓬松、色暗, 有回生現(xiàn)象[7]。遺憾的是, 目前有關(guān)淀粉合成和調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要來(lái)自擬南芥和水稻等模式植物, 谷子相關(guān)研究較少[8-9]。

隨著高通量測(cè)序的簡(jiǎn)單化和低成本化, 利用二代測(cè)序技術(shù)大規(guī)模開(kāi)發(fā)谷子分子標(biāo)記并解析小米品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀成為可能。2012年, 由美國(guó)國(guó)家能源部所屬的聯(lián)合基因組研究所和中國(guó)華大基因分別進(jìn)行的豫谷1號(hào)和張谷的全基因組測(cè)序工作相繼完成[10-11], 從此谷子功能基因組學(xué)研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。此后, 一大批基于全基因組測(cè)序的分子標(biāo)記相繼被開(kāi)發(fā)[12-16]。Bai等[16]對(duì)十里香谷子品種進(jìn)行了基因組重測(cè)序, 通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)十里香和豫谷1號(hào)基因組之間存在762 082個(gè)SNP, 26 802個(gè)1~5 bp InDels和10 109個(gè)結(jié)構(gòu)變異; 而十里香和張谷基因組之間存在915 434個(gè)SNP、28 546個(gè)InDels和12 968個(gè)結(jié)構(gòu)變異。最近, 王軍等[17]利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了一張1648.8 cM的谷子高密度遺傳圖譜, 并定位了8個(gè)農(nóng)藝性狀的11個(gè)主效QTL。我國(guó)谷子種質(zhì)資源非常豐富, 在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化和人工選擇中積累了大量自然變異。2013年, 我國(guó)科學(xué)家聯(lián)合完成了916份谷子種質(zhì)資源全基因組低倍重測(cè)序和單倍體型圖譜的構(gòu)建工作, 為谷子基因資源的發(fā)掘和遺傳改良提供了海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息[18]。

晉谷21原名晉汾7號(hào), 由晉汾52經(jīng)鈷60 γ射線輻射和連續(xù)單株選育而成[19]。其米色金黃發(fā)亮, 細(xì)柔光滑, 品質(zhì)和產(chǎn)量均超過(guò)歷史名米沁州黃[19]。晉谷21于1992年榮獲中國(guó)首屆農(nóng)業(yè)博覽會(huì)銀獎(jiǎng), 1994年獲山西省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng), 1995年被國(guó)家科委列入國(guó)家成果重點(diǎn)推廣項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)晉谷21進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 鑒定出614個(gè)新基因, 并優(yōu)化了7175個(gè)已注釋基因的結(jié)構(gòu), 為晉谷21優(yōu)異米質(zhì)基因的發(fā)掘奠定了基礎(chǔ)[20]。盡管如此, 由于缺少晉谷21的基因組信息, 限制了晉谷21優(yōu)異米質(zhì)連鎖分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和相關(guān)基因的克隆。為此, 本研究利用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)晉谷21進(jìn)行了全基因組重測(cè)序, 并將其與豫谷1號(hào)參考基因組比較, 開(kāi)發(fā)了大量InDel和SNP分子標(biāo)記, 并將其應(yīng)用于晉谷21衍生種的分析。本研究不僅為晉谷21優(yōu)異米質(zhì)相關(guān)基因的發(fā)掘和分子育種奠定了基礎(chǔ), 同時(shí)也為其他谷子品種的相關(guān)研究提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)條件

全基因組重測(cè)序材料為大田種植的健康無(wú)病蟲(chóng)害的晉谷21單株植株, 選取15份谷子種質(zhì)資源(表1)進(jìn)行引物通用性分析。編號(hào)7~15的種質(zhì)資源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的刁現(xiàn)民研究員饋贈(zèng), 其余資源為本實(shí)驗(yàn)室保存或創(chuàng)制。所有材料均種植于山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田內(nèi)。

1.2 基因組DNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序

采用改良的CTAB法[21]提取用于PCR模板的谷子基因組DNA: 取0.1 g新鮮谷子葉片, 加入0.6 mL CTAB提取液, 利用高通量組織研磨機(jī)(寧波新芝SCIENTZ-48)充分破碎; 然后加入500 μL氯仿/異戊醇(24∶1, v/v)進(jìn)行抽提; 最后取上清液加入等體積的異丙醇以沉淀DNA。重測(cè)序用晉谷21基因組的提取采用高效植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司, 貨號(hào)DP350], 提取操作嚴(yán)格按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。利用配備μCuvette G1.0超微量比色皿的BioSpectrometer分光光度計(jì)(PCR用)或者Qubit熒光定量?jī)x(重測(cè)序用)測(cè)定基因組DNA的濃度和純度, 并用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

表1 15份谷子種質(zhì)資源信息

由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司嚴(yán)格按照Illumina提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序: 將5 μg基因組DNA隨機(jī)打斷, 進(jìn)行片段化; 電泳回收所需長(zhǎng)度的DNA片段, 進(jìn)行末端修復(fù)并加上接頭制備雙端測(cè)序文庫(kù), 利用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)分析及InDel和SNP檢測(cè)

利用Illunima Casava軟件對(duì)晉谷21經(jīng)Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行堿基識(shí)別, 將其轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序讀段(raw reads)。為了保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量, 首先將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾, 去除帶接頭、N所占比例大于5%或質(zhì)量值≤5的堿基超過(guò)50%的低質(zhì)量測(cè)序序列, 從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。

利用BWA軟件[22]將晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到豫谷1號(hào)參考基因組[10], 以定位干凈讀段(clean reads)在參考基因組上的位置, 統(tǒng)計(jì)晉谷21基因組測(cè)序深度和基因組覆蓋度等信息, 并進(jìn)行InDel和SNP變異的檢測(cè)。InDel和SNP的檢測(cè)利用基因組分析工具包(Genome Analysis Toolkit, GATK) GATK[23]進(jìn)行, 具體流程為: (1)使用Picard軟件包(https://sourceforge.net/projects/picard/)的Mark Duplicate工具去除重復(fù)序列, 以消除PCR復(fù)制的影響; (2)使用基因組分析工具包(Genome Analysis Toolkit, GATK)[23]對(duì)SNP和InDel附近位點(diǎn)進(jìn)行局部重新比對(duì), 校正由于堿基變異產(chǎn)生的比對(duì)結(jié)果錯(cuò)誤; (3)校正堿基質(zhì)量值; (4)檢測(cè)InDel和SNP變異位點(diǎn)。

1.4 基于重測(cè)序數(shù)據(jù)的InDel和CAPS分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和引物設(shè)計(jì)

選取晉谷21和豫谷1號(hào)差異堿基數(shù)在13~50 bp的InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)InDel引物, 引物設(shè)計(jì)原則為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~250 bp, 且晉谷21和豫谷1號(hào)之間的差異在8%以上?；跁x谷21重測(cè)序獲得的SNP位點(diǎn)信息, 利用在線軟件dCAPS Finder 2.0[24]分析最佳酶切位點(diǎn)和選擇限制性內(nèi)切核酸酶, 并設(shè)計(jì)酶切擴(kuò)增多態(tài)性(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)標(biāo)記引物, 引物設(shè)計(jì)原則為PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度500~1000 bp。

1.5 PCR 擴(kuò)增及標(biāo)記驗(yàn)證

PCR體系為20 μL, 包括基因組DNA約50 ng、10× PCR 緩沖液 2 μL, 2 mmol L–1dNTPs 2 μL, 10 μmol L–1上下游引物各2 μL和1 UDNA聚合酶。用2.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR或者酶切產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 晉谷21基因組重測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Illumina paired-end雙端測(cè)序, 共獲得15.45 Gb的晉谷21基因組原始數(shù)據(jù)(raw data)。經(jīng)質(zhì)量評(píng)估和過(guò)濾, 最終獲得83.05 Mb clean reads, 共計(jì)14.95 Gb的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù), 測(cè)序深度達(dá)到36.9×(表2)。其中, 質(zhì)量值大于等于30的堿基達(dá)到92.96%, 表明測(cè)序質(zhì)量較好(表2和圖1-A)。為保證結(jié)果的可靠性, 所有后續(xù)分析都基于上述過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

晉谷21基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)與豫谷1號(hào)參考基因組平均比對(duì)效率為96.16%, 其中雙端測(cè)序序列均定位到參考基因組上, 且距離符合測(cè)序片段長(zhǎng)度分布的占93.25%, 基因組覆蓋度為95.34% (至少覆蓋1×) (表2和圖1-B)。為了分析插入片段的實(shí)際大小, 檢測(cè)了雙端序列在參考基因組上的起止位置。結(jié)果表明插入片段長(zhǎng)度分布呈正態(tài)分布, 且只有一個(gè)單峰, 峰值長(zhǎng)度約為480 bp, 這表明測(cè)序數(shù)據(jù)文庫(kù)構(gòu)建符合要求(圖1-C)。

表2 晉谷21全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)信息匯總

圖1 晉谷21基因組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

A: 堿基質(zhì)量分布圖; B: 測(cè)序深度分布曲線; C: 測(cè)序文庫(kù)插入片段大小分布圖。

A: base quality distribution; B: sequencing-depth distribution curve; C: insert size distribution of the sequencing library.

2.2 基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)的InDel分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

根據(jù)樣品晉谷21的測(cè)序讀段在豫谷1號(hào)參考基因組上的定位結(jié)果, 利用GATK軟件包檢測(cè)晉谷21與豫谷1號(hào)之間是否存在InDel。共發(fā)現(xiàn)169 037個(gè)InDel位點(diǎn), 平均密度為417.37個(gè) Mb–1, 這些InDel共導(dǎo)致了1752個(gè)基因發(fā)生變異。其中, 14 578個(gè)InDel位點(diǎn)差異片段長(zhǎng)度在13~50 bp之間; 34 733個(gè)InDel位點(diǎn)差異片段長(zhǎng)度在4~12 bp之間; 117 406個(gè)InDel位點(diǎn)差異片段長(zhǎng)度在1~3 bp之間(圖2)。

圖2 晉谷21和豫谷1號(hào)基因組間的InDel統(tǒng)計(jì)

正負(fù)數(shù)分別表示晉谷21基因組中插入(正數(shù))或者缺失(負(fù)數(shù))的堿基數(shù)。

The positive and negative numbers indicate the number of insertion (positive) or deletion (negtive) of base in the Jingu 21 genome.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證候選InDel標(biāo)記的準(zhǔn)確性, 根據(jù)其在染色體上的分布情況, 篩選并設(shè)計(jì)了68對(duì)代表性InDel標(biāo)記引物(附表1)。其中, 8對(duì)位于第1染色體, 8對(duì)位于第2染色體, 11對(duì)位于第3染色體, 8對(duì)位于第4染色體, 7對(duì)位于第5染色體, 6對(duì)位于第6染色體, 6對(duì)位于第7染色體, 6對(duì)位于第8染色體, 8對(duì)位于第9染色體(圖3和附表1)。為了檢測(cè)開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記的準(zhǔn)確性和上述引物的有效性, 以豫谷1號(hào)和晉谷21基因組為模板, 進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。結(jié)果表明, 上述68對(duì)引物均能擴(kuò)增出特異條帶。進(jìn)一步分析表明, 61對(duì)引物在豫谷1號(hào)和晉谷21之間具有多態(tài)性, 且擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期結(jié)果; 7對(duì)引物無(wú)多態(tài)性或者大小與預(yù)期不符(圖3和附表1)。

2.3 基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)的SNP/CAPS分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與檢測(cè)

使用GATK軟件工具包對(duì)晉谷21基因組DNA進(jìn)行SNP檢測(cè), 共獲得1 167 555個(gè)SNP, 平均密度為2912.33個(gè) Mb–1。其中, 同類型堿基之間突變的轉(zhuǎn)換型SNP位點(diǎn)851 065個(gè), 不同類型堿基之間的顛換型SNP位點(diǎn) 316 490個(gè); 純合的SNP位點(diǎn)為1 146 969個(gè), 雜合的SNP位點(diǎn)為20 586個(gè), 純合率為98.24%。利用SnpEff軟件[25]對(duì)上述SNP進(jìn)行了注釋, 發(fā)生在非編碼區(qū)的突變?yōu)? 117 744個(gè), 發(fā)生在編碼區(qū)的突變?yōu)?9 811個(gè), 這些SNP共導(dǎo)致7098個(gè)基因發(fā)生非同義突變(表3)。

圖3 InDel標(biāo)記在晉谷21和豫谷1號(hào)的多態(tài)性分析

InDel標(biāo)記詳細(xì)信息見(jiàn)附表1, 每個(gè)分子標(biāo)記的第1個(gè)樣品為晉谷21, 第2個(gè)樣品為豫谷1號(hào)。M: D2000 DNA Marker [天根生化科技(北京)有限公司, #MD114]。1~11代表該標(biāo)記在附表1中的順序。

The detailed information of the InDel markers are listed in the supplemental table 1. The first and the second lanes of each marker are Jingu 21 and Yugu 1 respectively. M: D2000 DNA Marker [Tiangen Biotech (Beijing) Co. Ltd., #MD114]. 1~11 represent the order of the markers in supplemental Table 1.

為了驗(yàn)證上述SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性, 我們選取了第3染色體位點(diǎn)14 938 250的SNP進(jìn)行了驗(yàn)證。在該SNP位點(diǎn)參考基因組序列為C, 而晉谷21為堿基T, 從而導(dǎo)致晉谷21產(chǎn)生了一個(gè)新的I酶切位點(diǎn)。據(jù)此, 設(shè)計(jì)CAPS標(biāo)記引物(5′-TTGAGATTTTGC TGGCGATTGG-3′和5′-CGGCATACTTTTGTCACC CTAC-3′), 并利用晉谷21和豫谷1號(hào)基因組DNA進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。如圖4所示, 晉谷21和豫谷1號(hào)都可以擴(kuò)增出清晰條帶, 且二者條帶大小相同。利用I酶切后, 晉谷21片段可以切割成424 bp和538 bp兩個(gè)片段, 而豫谷1號(hào)片段不能被切割(圖4)。上述結(jié)果與預(yù)期相符, 表明基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的該SNP位點(diǎn)是正確的。

2.4 基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的通用性

選取了1份狗尾草、2份谷莠子和12份谷子, 共計(jì)15份種質(zhì)資源驗(yàn)證基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的InDel和SNP/CAPS分子標(biāo)記的通用性。結(jié)果表明, 9對(duì)InDel引物都可以在15個(gè)谷子種質(zhì)資源中進(jìn)行有效的擴(kuò)增(表1)。其中標(biāo)記2G5501976僅在晉谷21背景的種質(zhì)資源和其他13個(gè)種質(zhì)資源之間有多態(tài)性, 而在其他13個(gè)種質(zhì)資源之間無(wú)多態(tài)性; 其余8個(gè)InDel標(biāo)記在所有種質(zhì)資源中多態(tài)性都較好(圖5-A)。類似地, 基于SNP重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的CAPS標(biāo)記3G14938250也可以在其他谷子種質(zhì)資源中有效擴(kuò)增, 且利用I酶切后表現(xiàn)出較好的多態(tài)性(圖5-B)。這表明基于晉谷21全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的InDel和SNP/CAPS分子標(biāo)記在包括狗尾草和谷莠子在內(nèi)的其他谷子種質(zhì)資源中具有通用性, 可用于其他谷子種質(zhì)資源的相關(guān)研究。

表3 SNP注釋結(jié)果

圖4 CAPS標(biāo)記3G14938250對(duì)晉谷21和豫谷1號(hào)的多態(tài)性分析

1: 晉谷21 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物; 2: 豫谷1號(hào) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物; 3: 晉谷21 PCR產(chǎn)物的I酶切結(jié)果; 4: 豫谷1號(hào)PCR 產(chǎn)物I的酶切結(jié)果; M: D2000 DNA marker [天根生化科技(北京)有限公司, #MD114]。

1: PCR amplicon of Jingu 21; 2: PCR amplicon of Yugu 1; 3: PCR amplicon of Jingu 21 digested withI; 4: PCR amplicon of Yugu 1 digested withI; M: D2000 DNA marker [Tiangen Biotech (Beijing) Co. Ltd., #MD114].

圖5 InDel和CAPS標(biāo)記在15個(gè)谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析

A: InDel標(biāo)記在15個(gè)谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析; B: CAPS標(biāo)記在15個(gè)谷子種質(zhì)資源的多態(tài)性分析。1~15為谷子種質(zhì)資源, 詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

A: Polymorphic analysis of InDel markers among 15 foxtail millet germplasm resources; B: Polymorphic analysis of CAPS marker among 15 foxtail millet germplasm resources. The foxtail millet germplasm (1–15) is listed in Table 1.

3 討論

3.1 基于二代重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)晉谷21全基因組分子標(biāo)記

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及豫谷1號(hào)和張谷等谷子基因組測(cè)序的完成, 利用二代重測(cè)序技術(shù)在全基因組水平開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記已經(jīng)成為可能。Jia等[18]對(duì)包括晉谷21在內(nèi)的916份谷子種質(zhì)資源進(jìn)行了重測(cè)序, 但測(cè)序深度較低, 平均僅為0.7×, 導(dǎo)致晉谷21的SNP數(shù)據(jù)不全, 且無(wú)法開(kāi)發(fā)InDel標(biāo)記。本研究利用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)名優(yōu)谷子品種晉谷21進(jìn)行了36.9×深度測(cè)序, 并開(kāi)發(fā)了169 037個(gè)InDel標(biāo)記和1 167 555個(gè)SNP標(biāo)記, 對(duì)晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成分子機(jī)制的解析具有重要價(jià)值。

與SSR標(biāo)記一樣, InDel標(biāo)記反映的也是DNA 片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。由于受到測(cè)序深度和算法等的限制, 過(guò)去往往僅能檢測(cè)到較小的InDel, 一般小于10 bp[26]。如Bai等[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的谷子InDel標(biāo)記長(zhǎng)度為1~5 bp, 檢測(cè)這些小的InDel非常困難。為了解決這一問(wèn)題, 本研究采用了36.9×深度測(cè)序, 檢測(cè)的InDel的長(zhǎng)度在1~269 bp之間。其中, 差異片段長(zhǎng)度在13~50 bp之間的InDel位點(diǎn)為14 578個(gè), 約占InDel標(biāo)記總數(shù)的8.62% (圖2)。這些InDel標(biāo)記只需要普通瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè), 與需要聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)的SSR標(biāo)記相比, 可以大大節(jié)省人力和物力。

3.2 基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性和通用性

設(shè)計(jì)的68對(duì)InDel引物中有61對(duì)其擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相同, 且呈現(xiàn)出較好的多態(tài)性; 而另外7對(duì)擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期不符, 占所有引物的10.29% (圖3)。分別對(duì)1G19650142和3G34758465兩個(gè)標(biāo)記的豫谷1號(hào)和晉谷21擴(kuò)增片段的測(cè)序表明, InDel標(biāo)記1G19650142 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為第9染色體23 837 024~ 23 837 239之間216 bp的片段; 而3G34758465 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為第6染色體10 398 380~10 398 547之間168 bp的片段(王興春等, 未發(fā)表數(shù)據(jù))。這表明擴(kuò)增片段大小與預(yù)期不符是非特異擴(kuò)增而不是高通量測(cè)序或者生物信息學(xué)分析錯(cuò)誤導(dǎo)致的。因此, 建議在設(shè)計(jì)InDel標(biāo)記引物時(shí)將候選引物序列與豫谷1號(hào)參考基因組比對(duì), 選擇單一結(jié)合位點(diǎn)的引物。

分子標(biāo)記的通用性可以大大節(jié)約開(kāi)發(fā)成本, 提高分子標(biāo)記利用效率。但以往研究多集中在SSR標(biāo)記的通用性方面, 而有關(guān)InDel和SNP等標(biāo)記通用性的研究較少[27-28]。本研究表明, 基于晉谷21開(kāi)發(fā)的InDel和SNP/CAPS標(biāo)記也具有較好的通用性, 可用于其他谷子及其近緣野生種狗尾草和谷莠子的相關(guān)研究(圖5), 但這些標(biāo)記是否可用于其他禾谷類作物還有待進(jìn)一步研究。此外, InDel分子標(biāo)記2G5501976多態(tài)性較差, 在除晉谷21背景之外的13個(gè)種質(zhì)資源之間無(wú)多態(tài)性。因此, 該InDel標(biāo)記可以作為晉谷21特異標(biāo)記, 僅用該標(biāo)記即可高效區(qū)分是否為晉谷21及其衍生品種。

3.3 基于晉谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記在小米品質(zhì)研究和育種中的應(yīng)用

小米的品質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀, 受眾多基因調(diào)控。傳統(tǒng)方法開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記數(shù)量有限, 難以對(duì)品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀相關(guān)基因進(jìn)行精細(xì)定位。本研究開(kāi)發(fā)了169 037個(gè)InDel位點(diǎn)和1 167 555個(gè)SNP位點(diǎn), 平均密度分別為28.58個(gè) Mb–1和2289.32個(gè) Mb–1, 完全可以滿足小米品質(zhì)等復(fù)雜農(nóng)藝性狀基因精細(xì)定位的需求。InDel標(biāo)記2G5501976是晉谷21及其衍生品種的特異分子標(biāo)記, 是這些品種中基因啟動(dòng)子缺失14 bp導(dǎo)致的。基因編碼一個(gè)真核生物翻譯起始因子, 該基因與晉谷21優(yōu)異米質(zhì)的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。此外, 目前水稻中已經(jīng)克隆了一大批外觀品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分和香味等品質(zhì)相關(guān)的基因[8]。通過(guò)序列比對(duì), 篩選谷子中的同源基因, 結(jié)合本研究鑒定的InDel和SNP位點(diǎn), 進(jìn)一步研究上述品質(zhì)相關(guān)基因在晉谷21中的變異情況, 從而有望揭示晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

檢測(cè)到169 037個(gè)InDel位點(diǎn)和1 167 555個(gè)SNP位點(diǎn), 初步揭示了晉谷21的基因組信息。開(kāi)發(fā)了InDel和CAPS分子標(biāo)記, 為深入解析晉谷21優(yōu)異米質(zhì)形成的分子機(jī)制和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)?；跁x谷21重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的InDel和SNP標(biāo)記在狗尾草、谷莠子和谷子等谷子種質(zhì)資源具有通用性, 可用于谷子種質(zhì)資源鑒定、遺傳分析、基因圖位克隆和雜交種鑒定。

致謝:感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的刁現(xiàn)民研究員提供了谷子種質(zhì)資源(表1編號(hào)7~15)。

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Genome-wide Identification of Molecular Markers Based on Genomic Re-sequencing of Foxtail Millet Elite Cultivar Jingu 21

ZHAO Qing-Ying1,**, ZHANG Rui-Juan2,**, WANG Rui-Liang2, GAO Jian-Hua2,3, HAN Yuan-Huai3,4, YANG Zhi-Rong1,3,4,*, and WANG Xing-Chun2,3,4,*

1College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;3Institute of Agricultural Bioengineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;4Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taigu 030801, Shanxi, China

Foxtail millet becomes more and more popular for its rich nutrients, and the grain quality is the key concern that consumers would consider when selecting millet brand. Jingu 21 is an elite cultivar with high edible quality. However, the lack of genomic information impedes studies on the molecular mechanisms of millet quality formation. Here, we re-sequenced the whole genome of Jingu 21 using high-throughput sequencing technology, and obtained 14.95 Gb high quality data. By comparing sequence of Jingu 21 with the reference genome of Yugu 1, we identified 169 037 InDels and 1 167 555 SNPs. Of these InDels, 14 578 could be detected easily by agarose gel electrophoresis. One SNP and 68 InDel markers were selected to verify the polymorphism between Jingu 21 and Yugu 1, showing that the InDel and SNP markers developed by using next generation sequencing technology were reliable. Although the InDel and SNP markers were generated based on genome re-sequencing data of the elite cultivar Jingu 21, they could also be used for research on other foxtail millet, green foxtail, and giant foxtail. Moreover, a specific InDel marker 2G5501976 for Jingu 21 was developed, which could be used to identify Jingu 21 and its derivative varieties. Taken all together, the genomic characterization of Jingu 21 not only lays a foundation for elucidating the molecular mechanisms of high quality formation, but also provides a large number of molecular markers for marker-assisted selection of high qua-lity millet, genetic analysis and map-based cloning.

foxtail millet; Jingu 21; InDel; SNP; molecular marker; genome re-sequencing

2017-09-11;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00686

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471502, 31600289, 31371693, 31771810), 山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201601D011071), 山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2015-067)和山西省留學(xué)回國(guó)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目(2014-11)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31471502, 31600289, 31371693, 31771810), the Natural Science Foundation of Shanxi Province (201601D011071), the Research Project from Shanxi Scholarship Council of China (2015-067) and the Fund Program for the Scientific Activities of Selected Returned Overseas Professionals in Shanxi Province (2014-11).

楊致榮, E-mail: zryangsx@163.com; 王興春, E-mail: wxingchun@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: 192015271@qq.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180128.2016.008.html