方俊 董偉 彭宏峰 徐艷麗 賈婉萍 梁立碩 梁永強(qiáng)

華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院1正畸科，2頜面外科（河北唐山 063000）

2000年我國衛(wèi)生部門的統(tǒng)計(jì)顯示，我國骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率占全國總?cè)丝诘?%左右。有研究顯示，骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折的概率高且愈合更加困難［1］。與正常骨組織相比，骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性均有降低，骨缺損修復(fù)較慢［2］。

透鈣磷石復(fù)合材料是一種具有良好生物相容性和成骨作用的骨修復(fù)材料，但因其降解速度過快，常導(dǎo)致骨修復(fù)作用并不明顯。鍶可以影響骨基質(zhì)的形成，促進(jìn)新骨生成，并且鍶還可以抑制骨的吸收［3-4］。將鍶元素加入透鈣磷石中，利用透鈣磷石良好的溶解性可以將鍶元素很好地釋放到缺損部位，從而促進(jìn)骨缺損的愈合。實(shí)驗(yàn)將探究摻鍶5%透鈣磷石骨水泥對骨質(zhì)疏松家兔骨缺損的修復(fù)效果，以期在修復(fù)中能起到一定的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雌性家兔18只，體質(zhì)量2.5～2.7 kg，由華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、透鈣磷石組和摻鍶5%透鈣磷石組，每組各6只。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循動(dòng)物倫理委員和管理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑二水合磷酸氫鈣，碳酸鈣，無水乙醇，磷酸二氫鈣，焦磷酸鈉，氯化鍶，乙醇酸。

1.2 方法

1.2.1 骨水泥的制備將250 g二水合磷酸氫鈣和72.7 g碳酸鈣充分溶解于500 mL超純水中，樣品充分干燥后研磨，在1 100℃的馬弗爐中煅燒10 h。將煅燒后的樣本以無水乙醇為介質(zhì)充分研磨，將分散液離心除去乙醇，在60℃的烘干箱中干燥48 h，將樣本磨碎得到β?磷酸三鈣粉末。用β?磷酸三鈣、磷酸二氫鈣和焦磷酸鈉制備成透鈣磷石骨水泥，以鍶/（鍶+鈣）為10%在透鈣磷石中加入氯化鍶制得摻鍶5%透鈣磷石骨水泥，將制得的骨水泥在模具中固化定型，24 h后取出，紫外線消毒備用。

1.2.2 骨質(zhì)疏松模型的制備用2 mL/kg的水合氯醛從耳緣靜脈給藥進(jìn)行麻醉，在無菌環(huán)境下，從腹白線處切開腹膜約2 cm，在子宮上方尋找兩側(cè)卵巢，切除兩側(cè)卵巢，關(guān)閉腹腔，傷口撒青霉素。術(shù)后每日肌注青霉素160萬U。術(shù)后1周，骨質(zhì)疏松組開始肌注地塞米松，0.5 mg/kg，每周2次，共8周。

1.2.3 骨水泥的植入用2 mL/kg的水合氯醛從耳緣靜脈給藥進(jìn)行麻醉，在無菌環(huán)境下沿兔口角下緊貼下頜骨上緣、口角后10 mm處皮膚，向磨牙方向做一長約20 mm的切口，暴露下頜骨骨面用低速手機(jī)在頦孔前1 mm處做一長10 mm、寬4 mm、高3 mm的骨缺損，取消毒好的骨水泥塊，生理鹽水沖洗后置于骨缺損處，縫合傷口，術(shù)后3 d每日肌注青霉素40萬U［5］。

1.2.4 觀察指標(biāo)和方法（1）骨質(zhì)疏松模型的測定：隨機(jī)選取9只家兔用于骨密度的測量，分別在術(shù)前3 d、術(shù)后8、12周進(jìn)行家兔腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）的測量。術(shù)后BMD小于術(shù)前BMD減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差則表示造模成功［6］。（2）骨損修復(fù)的測定：于術(shù)后4、8周處死各組動(dòng)物3只，分離取出下頜骨，生理鹽水沖洗，于固定液中固定12 h后拍攝X線片，觀察骨缺損的修復(fù)情況。將分離的下頜骨完全浸入脫鈣液中，每3天更換一次脫鈣液，4℃下保存8周，充分清洗后，常規(guī)石蠟包埋、切片。免疫組化觀察b?FGF的表達(dá)，用Image?Pro Plus6.0軟件測量各組的光密度值（MOD值）進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松模型的建立BMD結(jié)果顯示術(shù)前3 d、術(shù)后8、12周家兔BMD值有差異（P＜0.05）；12周時(shí)術(shù)后BMD小于術(shù)前BMD減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差，提示造模成功。

2.2 X線表現(xiàn)根據(jù)新骨形成的X線評(píng)價(jià)系統(tǒng)對修復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算各組的平均得分［7］，新生骨占缺損底部到頂部距離的0%～25%，記1分；新生骨占缺損底部到頂部距離的26%～50%，記2分；新生骨占缺損底部到頂部距離的51%～75%，記3分；新生骨占缺損底部到頂部距離的76%～100%，記4分；未見新生骨生成，記0分。術(shù)后4周，空白組呈明顯的缺損低密度影，平均得分0；透鈣磷石組缺損區(qū)可見明顯的高密度塊狀影，為骨水泥未吸收影像，有少量新生骨生成，平均得分0.3；5%摻鍶透鈣磷石組缺損區(qū)有霧狀高密度影出現(xiàn)，提示骨水泥大部分溶解，可見缺損底部有新骨生成，平均得分1。術(shù)后8周，空白組缺損區(qū)域修復(fù)呈淺凹坑狀，平均得分1.7；透鈣磷石組缺損區(qū)大部分修復(fù)，缺損表面有凹陷，平均得分3.2；5%摻鍶透鈣磷石組缺損區(qū)基本修復(fù)，可見明顯的骨小梁結(jié)構(gòu)，平均得分4。見圖1、2。2.3 免疫組化結(jié)果利用Image?Pro Plus 6.0分析得出其MOD值來評(píng)價(jià)其陽性率。4周時(shí)，3組的陽性表達(dá)率均較高，5%摻鍶透鈣磷石組＞透鈣磷石組＞空白組，空白組缺損邊緣有少量的成纖維細(xì)胞；透鈣磷石組缺損區(qū)有成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞聚集；5%摻鍶透鈣磷石組中可見大量的成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。8周時(shí)，3組陽性表達(dá)率有所降低，5%摻鍶透鈣磷石組＞透鈣磷石組＞空白組，空白組未見新骨形成；透鈣磷石組有骨小梁存在，周圍有少量基質(zhì)呈陽性表達(dá)；5%摻鍶透鈣磷石組有骨性結(jié)構(gòu)存在，b-FGF陽性表達(dá)部位較少。見圖3、4、表1。

圖1 4周時(shí)3組X線結(jié)果Fig.1 The X?ray results of the 3 groups at 4 weeks

圖2 8周時(shí)3組X線結(jié)果Fig.2 The X?ray results of the 3 groups at 4 weeks

圖3 4周時(shí)3組b?FGF的表達(dá)情況（× 200）Fig.3 The expression of the 3 groups of b?FGF at 4 weeks（× 200）

圖4 8周時(shí)3組b?FGF的表達(dá)情況（× 200）Fig.4 The expression of the 3 groups of b?FGF at 8 weeks（× 200）

3 討論

透鈣磷石骨水泥是臨床常用的一種骨修復(fù)材料，具有良好的生物相容性、溶解性和生物活性［8］。本實(shí)驗(yàn)為了能夠同時(shí)觀察骨水泥的溶解情況和新骨的生成情況，從而判斷摻鍶透鈣磷石在體內(nèi)是否會(huì)加速溶解，并且能夠促進(jìn)新骨的生成，故采用X線片來觀察缺損區(qū)的修復(fù)情況。黃旋平等［9］的實(shí)驗(yàn)說明了通過X線評(píng)判新生骨的可行性。ZHAO等［7］的實(shí)驗(yàn)提供了一種通過X線評(píng)判新生骨的方法。實(shí)驗(yàn)中X線片結(jié)果顯示：4周時(shí)，透鈣磷石組骨水泥基本未溶解吸收，而5%摻鍶透鈣磷石組骨水泥大部分溶解吸收，且新骨生成的量平均要大于透鈣磷石組，說明在加入5%的鍶后，透鈣磷石的溶解性更好。原因可能是鍶元素和鈣元素相近，但離子半徑要大于鈣離子，透鈣磷石中的鈣被鍶替換后，其單位體積變大，原有晶格發(fā)生畸變，從而改變原有材料的結(jié)晶性和生物降解性，所以摻鍶透鈣磷石的降解性會(huì)更好，更有利于骨組織的修復(fù)［11，17］。8周時(shí)，5%摻鍶透鈣磷石組的骨修復(fù)能力優(yōu)于透鈣磷石組，原因可能是加入鍶元素后的透鈣磷石骨水泥溶解速度加快，鍶元素被大量釋放，而鍶元素具有增強(qiáng)前成骨細(xì)胞的復(fù)制和成骨細(xì)胞的功能性活動(dòng)，并且可以抑制破骨細(xì)胞的吸收，從而促進(jìn)了新骨的形成［12，18］。LUO等［10］的實(shí)驗(yàn)表明摻鍶透鈣磷石骨水泥在體外模擬實(shí)驗(yàn)中有很好的溶解性，且能誘導(dǎo)新骨的生成。本實(shí)驗(yàn)表明摻鍶透鈣磷石骨水泥在動(dòng)物體內(nèi)也能有很好的溶解性和誘導(dǎo)新骨形成，為以后臨床的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的依據(jù)。

表1 各組b?FGF陽性表達(dá)部位MOD值的比較Tab.1 Comparison of MOD values of positive expression sites of b?FGF in each group（n=3） ±s

表1 各組b?FGF陽性表達(dá)部位MOD值的比較Tab.1 Comparison of MOD values of positive expression sites of b?FGF in each group（n=3） ±s

注：與空白組比較，*P＜0.05；與透鈣磷石組比較，#P＜0.05

組別空白組透鈣磷石組5%摻鍶透鈣磷石組F值P值4周0.166 5±0.019 3 0.208 2±0.018 2*0.243 6±0.015 1*#75.008＜0.001 8周0.136 7±0.018 7 0.158 7±0.015 4*0.184 7±0.017 6*#37.924＜0.001

b?FGF是人體內(nèi)重要的生長因子之一，可由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞等分泌，儲(chǔ)存于細(xì)胞外基質(zhì)中［13］。實(shí)驗(yàn)4、8周時(shí)，5%透鈣磷石組中的b?FGF陽性表達(dá)率均高于其他兩組，可能原因是鍶元素促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，成骨細(xì)胞分泌大量的b?FGF，而b?FGF通過刺激毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)毛細(xì)血管的形成，缺損區(qū)大量毛細(xì)血管的生成，又給其帶來豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和鈣元素，供其修復(fù)，且還可以帶來大量的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，參與新骨的形成［14，16］。這可能就是免疫組化結(jié)果中觀察到大量血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的原因。在8周時(shí)，5%摻鍶透鈣磷石組的b?FGF的陽性表達(dá)率較4周時(shí)要低，原因可能是8周時(shí)新骨趨于成熟，其中的毛細(xì)血管會(huì)相應(yīng)減少，成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活動(dòng)減少，導(dǎo)致了b?FGF的陽性表達(dá)率有所降低。有學(xué)者認(rèn)為b?FGF在缺損修復(fù)的后期會(huì)失去作用［15］，但實(shí)驗(yàn)中8周時(shí)5%摻鍶透鈣磷石組的陽性表達(dá)率依舊較其他兩組高，說明鍶元素在修復(fù)的后期依舊能對骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)起到一定的促進(jìn)作用。

總之，5%摻鍶透鈣磷石可以很好地修復(fù)骨質(zhì)疏松家兔下頜骨的缺損，為骨質(zhì)疏松骨缺損的修復(fù)提供了一些借鑒價(jià)值，其可能原因是促進(jìn)了b?FGF的大量生成，但未從分子機(jī)制方面得到印證，今后的實(shí)驗(yàn)可以從具體的信號(hào)途徑進(jìn)行更深入的研究。

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