張會(huì)敏 曲新艷 周喆 王升啟

1山東省中醫(yī)藥研究院（濟(jì)南250014）；2山東省分析測試中心（濟(jì)南 250014）；3中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（北京100850）

流感病毒可引起急性呼吸道傳染病，其中以甲型流感病毒傳染性最強(qiáng)，且易發(fā)生變異，易引起爆發(fā)性的流行。目前，甲型H1N1流感病毒檢測的常用技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)法、RT?PCR檢測［1］、膠體金檢測等。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（surface?enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有對(duì)樣品無損傷、用量少，檢測簡單、靈敏度高、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了常規(guī)拉曼光譜信號(hào)弱的缺點(diǎn)，因而近年來在臨床診斷、生物檢測、藥品非法添加快檢等［2-6］領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。國外學(xué)者通過SERS鑒定新出現(xiàn)的流感病毒［7］，研究表明無需樣品擴(kuò)增或標(biāo)記，SERS還可直接識(shí)別與毒力相關(guān)的流感NA突變［8］。因此，本文以納米銀溶膠為活性基底，采用便攜式拉曼光譜儀分別檢測正常組、模型組、達(dá)菲組小鼠血清拉曼增強(qiáng)光譜，并進(jìn)行正交校正的偏最小二乘辨別分析（OPLS?DA），初步探索基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的流感血清檢測方法，旨在為建立一種快速、簡便、低成本，可用于甲型H1N1流感病毒檢測的新技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料流感病毒株：甲型流感病毒亞型FM1小鼠適用株，由中國疾病預(yù)防控制中心提供。干預(yù)藥物：磷酸奧司他韋片（達(dá)菲），臨用前配成1 mg/mL；麻醉藥物：戊巴比妥鈉，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成10 mg/mL；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2012?0001］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器主要試劑：檸檬酸鈉、氯金酸；抗壞血酸、高氯酸銀；單晶硅片（浙江立晶）。主要儀器：i?Raman Plus BWS465?785H 便攜式拉曼光譜儀、back?illuminated CCD檢測器、低溫高速離心機(jī)、萬分之一電子天平、加樣槍、加熱磁力攪拌器、超聲清洗儀、Millli?Q超純水系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組將60只小鼠［體質(zhì)量（18±1）g，雄性］，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C）、病毒感染組（V）、達(dá)菲組（D）3組，每組20只（其中10只小鼠用于觀察死亡率、生存指數(shù)，評(píng)價(jià)流感模型造模是否成功）。適應(yīng)性喂養(yǎng)48 h后開始造模實(shí)驗(yàn)。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，麻倒后，吸取20 μL 4LD50的病毒液滴鼻攻毒，注意讓小鼠充分吸入病毒液。給藥方法：于感染病毒1 d后灌胃給藥，每只小鼠灌胃給藥劑量為0.2 mL/10 g，每天同一時(shí)間灌胃1次，正常對(duì)照組和模型組每天以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃6 d，觀察14 d。

1.3.2 血清制備分別于感染病毒后第3、5天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組取小鼠3只，摘眼球方式取血，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水8 h。不加抗凝劑，靜置2 h后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上清液即為血清。分裝之后保存于-80℃冰箱內(nèi)，備用。

1.3.3 RT?PCR測定肺組織中流感病毒RNA復(fù)制數(shù)稱取第3、5天各組肺組織（RNA Later浸泡）50 mg，置含有0.5 mL Trizol試劑的 EP管（2 mL，RNase?Free）中，將EP管置于勻漿機(jī)中研磨（60 Hz，60 s），Trizol法提取肺組織總RNA。按照Aglilent RNA 6000 Pico Quick Start Guide說明書，使用AGI?LENT 2100測定總肺組織總RNA完整性，然后使用甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）檢測肺勻漿中流感病毒RNA復(fù)制數(shù)。

1.3.4 納米膠體銀溶液的制備Lee法：稱取36 mg硝酸銀于燒瓶中，加200 mL水溶解，將溶液加熱至沸騰并磁力攪拌。然后，迅速加入4 mL新鮮1%（W/V）檸檬酸鈉溶液，保持溶液沸騰1 h，連續(xù)攪拌，至顏色變黃、灰，說明已形成納米膠體銀（AgNPs）溶液，冷卻，備用。

1.3.5 待測樣品處理取各組小鼠血清與納米膠體銀溶液按照不同比例混合，考察并優(yōu)選合適的比例；按照優(yōu)選出的比例將血清與納米膠體銀溶液混勻，靜置30 min，取2 μL混合液點(diǎn)樣于直徑為0.4 cm的硅片上，每份血清平行點(diǎn)樣3份，待室溫下干燥后，置拉曼光譜儀上進(jìn)行SERS圖譜測定，每個(gè)血清樣本測量3次，取平均值。

1.3.6 SERS光譜測試條件激發(fā)光波長為785 nm，光譜測量范圍為500～1 800 cm-1，光譜分辨率為2.0 cm-1，激發(fā)功率位20 mW，積分時(shí)間為10 s。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Bwspec4軟件進(jìn)行背景扣除和光譜平滑處理，并進(jìn)行歸一化處理，以減少光譜強(qiáng)度差異帶來的影響；運(yùn)用Simca?P+14.0對(duì)各組SERS數(shù)據(jù)進(jìn)行正交校正的偏最小二乘辨別分析（OPLS?DA）。

2 結(jié)果

2.1 血清:Ag NPs不同混合比例考察結(jié)果對(duì)血清與納米膠體銀溶液混合比例進(jìn)行了一系列考察，考察范圍為血清：Ag NPs（4∶1）至血清：Ag NPs（1∶20），SERS圖譜見圖1。由圖1可見，血清：Ag NPs（4∶1）至血清：Ag NPs（1∶4）對(duì)應(yīng)的 SERS 特征峰逐漸尖銳，說明隨著加入的Ag NPs增多，峰型越尖銳，激發(fā)強(qiáng)度增強(qiáng)，SERS特征峰越明顯；但當(dāng)加入的Ag NPs從4倍增大到20倍過程中，峰型基本上一致，沒有明顯變化。經(jīng)譜峰對(duì)比，最終選擇血清：Ag NPs（1∶4）作為血清與納米膠體銀溶液混合的最適比例。

圖1 血清：Ag NPs不同混合比例考察結(jié)果Fig.1 Results of Serum：Ag NPs mixed proportion

2.2 小鼠流感血清SERS特征圖譜由各組小鼠血清SERS譜圖2可知，1 650和1 330 cm-1分別是血清白蛋白的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ貢獻(xiàn)的拉曼特征峰［9］。1 006 cm-1為蛋白質(zhì)的側(cè)鏈苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)，該峰在蛋白質(zhì)的拉曼光譜中屬于強(qiáng)峰。1 204和1 590 cm-1也屬于苯丙氨酸的殘基特征峰［11］。在810 cm-1處有非常強(qiáng)的譜峰，屬于天冬氨酸的拉曼光譜。634、1 130 cm-1譜帶屬于碳水化合物D-甘露糖的特征譜帶［10］。血清中含量很低的糖類在銀膠體粒子聚集形成的“熱點(diǎn)”處，局域電場的強(qiáng)度得到提高，從而導(dǎo)致的SERS光譜也能被探測到。1 130、1 440 cm-1譜帶屬于脂類的特征拉曼峰［12］。在納米膠體銀作為SERS襯底下，血清中含量高的白蛋白及量非常低的成分如糖類和脂類都可以獲得的拉曼光譜［13］，見表1。參考文獻(xiàn)報(bào)道血清SERS圖譜特征峰歸屬對(duì)15個(gè)峰進(jìn)行了初步的震動(dòng)模式指認(rèn)。并選取1 076 cm-1作為分析譜線的標(biāo)準(zhǔn)，比較各組血清SERS圖譜特征峰強(qiáng)度差異，見表2。

圖2 各組小鼠血清SERS圖譜比較Fig.2 Comparison of serum SERS spectrum of mice in each group

流感病毒感染第3天時(shí)，流感病毒感染組小鼠血清在1 440、758、710 cm-1處SERS特征峰強(qiáng)于正常組，這些拉曼峰主要?dú)w屬于磷脂、D?甘露糖及輔酶、乙酰輔酶類成分；而流感病毒感染第5天時(shí)，流感病毒感染組小鼠血清在1 650、1 590、1 440、1 204、1 180、1 130、950、634 cm-1處SERS特征峰強(qiáng)于正常組，這些拉曼峰主要?dú)w屬于酰胺I、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、磷脂、乙?；咸烟?、β?胡蘿卜素、D?甘露糖、酪氨酸。可見，從感染流感病毒后第3～5天，流感病毒感染組小鼠血清SERS各特征峰信號(hào)明顯增強(qiáng)。

表1 小鼠流感血清SERS圖譜特征峰的歸屬及其振動(dòng)模式Tab.1 Characteristic attribution and vibrational modes of the SERS spectrum peaks of mice serum

表2 各組SERS圖譜特征峰差異Tab.2 Difference of characteristic peaks of SERS spectra in each group（n=9）

2.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.3.1 OPLS?DA分析結(jié)果運(yùn)用OPLS?DA對(duì)第3、5天正常組、病毒組、達(dá)菲組3種血清SERS光譜分別進(jìn)行組間差異分析。由圖3可見，在流感病毒感染第3天時(shí)，正常組與流感病毒感染組血清樣本之間具有明顯的組內(nèi)聚集和組間分離的趨勢(shì)，該模型的預(yù)測能力評(píng)估參數(shù)分別為R2X（cum）=0.662，R2Y（cum）=0.359，Q2（cum）=0.225，表明該模型的耐用性較高，而預(yù)測能力一般。由圖4可見，在流感病毒感染第5天時(shí)，正常組與流感病毒感染組血清樣本之間具有顯著的組內(nèi)聚集和組間分離的趨勢(shì)，該模型的預(yù)測能力評(píng)估參數(shù)分別為R2X（cum）=0.849，R2Y（cum）=0.707，Q2（cum）=0.555，表明該模型的耐用性較高，模型預(yù)測能力良好。由得分圖可直觀3種血清的得分值雖有少量的交叉重疊，但3種血清表現(xiàn)出較為明顯的分離趨勢(shì)。

圖3 流感病毒感染第3天各組血清樣本得分圖Fig.3 Serum samples score of third day after influenza virus infection

2.3.2 ROC曲線評(píng)估結(jié)果ROC曲線可反映模型預(yù)測能力的敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)。ROC曲線下面積（AUC）越大，模型預(yù)測能力越高。采用ROC曲線對(duì)OPLS?DA建立的3種血清SERS圖譜模型進(jìn)行評(píng)估，見圖5、6。在流感病毒感染第3天時(shí)，正常組、流感病毒感染組、達(dá)菲組3組的AUC分別為0.883、0.889、0.821；在流感病毒感染第5天時(shí)，正常組、流感病毒感染組、達(dá)菲組3組的AUC分別為1.00、0.969、0.994。結(jié)果表明，OPLS?DA分析能夠?qū)?組血清進(jìn)行良好的區(qū)分、鑒別。

圖4 流感病毒感染第5天各組血清樣本得分圖Fig.4 Serum samples score of fifth day after influenza virus infection

注：1，正常組；2，病毒組；3，達(dá)菲組。AUC（1）=0.882 716，AUC（2）=0.888 889，AUC（3）=0.820 988

2.4 各組肺組織中流感病毒RNA復(fù)制數(shù)的比較被感染器官內(nèi)病毒RNA的量決定了病毒復(fù)制的含量和病變的程度。RT?PCR結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織內(nèi)無病毒RNA表達(dá)，被流感病毒感染后，病毒組及達(dá)菲組小鼠第3天和第5天肺組織病毒RNA復(fù)制數(shù)均顯著增高。小鼠感染流感病毒后，給藥第3、5天，病毒組及達(dá)菲組肺組織中病毒RNA復(fù)制數(shù)差異均有顯著性（P＜0.01），見圖7。

3 討論

本文采用流感病毒滴鼻感染法造模，每組設(shè)置10只小鼠用于觀察死亡率、存活率，來評(píng)價(jià)流感模型造模是否成功。結(jié)果顯示，與正常組相比，病毒模型組動(dòng)物病死率為100%，平均存活時(shí)間為6.4 d，達(dá)菲組動(dòng)物病死率為10%，平均存活時(shí)間為13.3 d。結(jié)合感染小鼠均出現(xiàn)不同程度的流感樣發(fā)病癥狀，如弓背、聳毛、精神不振、毛發(fā)無光澤，喘息、發(fā)抖、飲食下降、閉眼，第5天開始出現(xiàn)聚堆，行走搖擺不定，極少活動(dòng)等現(xiàn)象，說明流感模型造模成功。

圖6 感染第5天各組血清SERS圖譜的ROC曲線圖Fig.6 ROC curve of serum SERS spectrum in each group after fifth day infection

圖7 各組肺組織中流感病毒RNA復(fù)制數(shù)的比較Fig.7 Comparison of the number of RNA replicas of influenza virus in lung tissues of each group

通過對(duì)測得的各組SERS譜峰進(jìn)行歸屬指認(rèn)發(fā)現(xiàn)，這些特征峰主要來自蛋白質(zhì)、脂類、堿基、多肽、氨基酸、碳水化合物等成分中各種化學(xué)鍵（官能團(tuán)）不同振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)模式，包括伸縮振動(dòng)、彎曲振動(dòng)等。從感染流感病毒后第3～5天，流感病毒感染組小鼠血清SERS各特征峰信號(hào)明顯增強(qiáng)（表2），這些信號(hào)增強(qiáng)的特征峰主要為酰胺I、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、磷脂、乙?；咸烟?、β?胡蘿卜素、D?甘露糖、酪氨酸等。血清中各種成分主要來源于細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子或者代謝物（包括藥物代謝物），血清中各種成分的改變是引起SERS譜峰差異的原因，而血清中各種成分的改變又可直接反映體內(nèi)組織細(xì)胞生理和病理的變化?？梢?，這些發(fā)生變化的SERS特征峰所對(duì)應(yīng)的成分與流感病毒對(duì)機(jī)體的影響有著密切的聯(lián)系。

OPLS?DA可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。由OPLS?DA對(duì)第3、5天正常組、病毒組、達(dá)菲組3種血清SERS光譜分別進(jìn)行組間差異分析結(jié)果可知，在第3、5天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，這3種血清均表現(xiàn)出較為明顯的分離趨勢(shì)（圖3、4）。由ROC曲線對(duì)OPLS?DA建立的3種血清SERS圖譜模型評(píng)估結(jié)果可見，OPLS?DA分析能夠?qū)?組血清進(jìn)行良好的區(qū)分、鑒別。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，SERS檢測鑒別結(jié)果與RT?PCR檢測鑒別結(jié)果一致。因此，利用所建立的SERS技術(shù)，結(jié)合OPLS?DA多元分析方法，將有望用于快速鑒別和診斷機(jī)體是否感染了流感病毒。

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