董晶萊，張金三，郭強，陳千杰，郭麗莎，李校堃

（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

胰腺癌是一類惡性程度高，預后差，生存率低的腫瘤[1-2]。胰腺癌細胞往往存在KRAS突變，而YAP1（Yes-associate protein 1）是突變KRAS下游重要的效應蛋白，參與腫瘤癌變進程[3]，有望成為治療胰腺癌的新靶點。YAP1是Hippo信號通路下游重要蛋白之一，在調控器官大小，細胞接觸抑制、增殖、腫瘤的形成等發(fā)面有重要作用[4-7]。YAP1有8個亞型，根據(jù)WW域的個數(shù)分一型和二型，含有1個WW域的為YAP1-1，含有2個的為YAP1-2。根據(jù)其轉錄激活結構域（transcriptional activation domain，TAD）是否插入片段，又分為YAP1-1α、β、γ、δ和YAP1-2α、β、γ、δ[8-10]。迄今為止，還未見相關YAP1各亞型的研究報道。本研究構建了pCI2-Flag-YAP1-1δ和2δ兩個亞型，為后續(xù)研究各亞型間的區(qū)別奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金公司，JM110感受態(tài)細胞購自上海唯地公司，HEK293人腎上皮細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，F(xiàn)aststart high fidelity PCR System購自美國Roche公司，DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京TIANGEN公司，ClaI限制性內切酶、SalI限制性內切酶購自美國NEB公司，T4連接酶購自美國Promega公司，lipo2000購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM、FBS、DMEM購自美國Gibco公司，考馬斯亮藍購自北京LEAGENE公司，Tris-HCl緩沖液購自北京Solarbio公司，5×Dual Color Protein Loading Buffer購自杭州弗德生物公司，PVDF膜購自美國BIO-RAD公司，YAP（D8H1X）一抗購自美國CST公司，β-actin Mouse mAb購自美國Sigma公司，兔二抗、鼠二抗購自安徽Biosharp公司，pCI2-Flag-YAP1-2γ質粒由本實驗室前期構建，PCR儀、電泳儀、曝光儀購自美國BIO-RAD公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒的擴增：由于后面實驗涉及到ClaI位點的酶切，且ClaI基因序列在DH5α感受態(tài)細胞中擴增時，酶切位點會被甲基化，從而影響限制性內切酶的酶切，所以需要重新將pCI2-Flag-YAP1-2γ質粒用JM110感受態(tài)細胞進行轉化。將質粒與JM110感受態(tài)細胞均勻混合，冰上孵育30 min，于37 ℃水浴熱激2 min，迅速拿出置于冰上2 min，再加500 μL的LB培養(yǎng)基于37 ℃的恒溫搖床孵育1 h，轉速150 r/min。取少量菌液于帶AMP抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌，37 ℃，150 r/min，12 h。用堿裂解法提取質粒備用。

1.2.2 pCI2-Flag-YAP1-2δ重組質粒的構建：PCR和酶切：pCI2-Flag-YAP1-2δ比pCI2-Flag-YAP1-2γ在結構上多了12個堿基（YAP1，Gene ID：10413），利用重疊PCR添加堿基的方法，進行兩步擴增。設計引物P1：5’-CGGAATTCATCGATCAGACAACAACATG-3’；P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCGTCGACTATAACCATGTAAGAAAGC TTTC-3’；P3：5’-CTTCGGCAGGTGAGGCCACAGGCAATGCGG AATATCAATCCCAGCA-3’；P4：5’-TCCGCATTGCCTGTGGCC TCACCTGCCGAAGCAGTTCTTGCTG-3’。以pCI2-Flag-YAP1-2γ為模板，用P1、P4和P2、P3這兩對引物分別進行PCR擴增，條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃20 s，58 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，共29個循環(huán)，最后72 ℃ 2 min，冷卻至4 ℃。通過DNA瓊脂糖凝膠判斷DNA片段是否正確，分別純化回收DNA片段，得到F1、F2兩個片段。取等量的F1和F2作為雙模板，選P1和P2為引物進行第二次PCR擴增，將所得到的擴增產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，確定正確后純化回收，得到所需片段F3，大小為980 bp。選取ClaI和SalI兩個限制性內切酶分別對pCI2-Flag-YAP1-2γ質粒和F3片段進行酶切，選取buffer3.1，室溫下過夜酶切。對酶切的pCI2-Flag-YAP1-2γ質粒進行膠回收，切取4500 bp左右的質粒骨架，包括pCI2骨架結構以及YAP1的前576個堿基。對F3片段進行酶切體系回收。

連接與轉化：將酶切回收的pCI2骨架片段和F3片段用T4連接酶進行快速連接，37 ℃水浴鍋連接2 h。連接產物用DH5α進行轉化，冰浴30 min，37 ℃熱激2 min，再加500 μL的LB培養(yǎng)基于37 ℃的恒溫搖床孵育1 h，轉速150 r/min。將菌液均勻涂布于帶AMP抗性的LB固體培養(yǎng)基，倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h。

質粒小提：挑取多個單克隆的菌落，置于5 mL的帶AMP抗性的LB液體培養(yǎng)基內，于恒溫搖床搖菌12 h，條件為37 ℃，150 r/min。將菌液離心，棄掉培養(yǎng)基，重懸，用堿裂解法裂解細菌，酸中和，可見白色絮狀沉淀，離心收集上清液，過柱純化，洗脫得到質粒。

1.2.3 重組質粒的鑒定：對重組質粒pCI2-Flag-YAP1-2δ分別進行酶切及基因測序鑒定。選取EcoRI和SalI限制性內切酶對提取的重組質粒進行雙酶切鑒定，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切片段大小驗證重組質粒是否構建成功；同時也對提取的重組質粒進行基因測序的鑒定，由于YAP1序列在1500 bp左右，相對較長，設計3條引物進行測序，①5′測序引物及序列CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；②YAP1-ClaI 5’：5’-AATCACATCGATCAGACAACAACATG-3’；③3′測序引物及序列YAP1-SalI-3’：5’-GAGGTCGAC TATAACCATGTAAGAAAGCTTTC-3’。

1.2.4 pCI2-Flag-YAP1-1δ重組質粒的構建：以鑒定正確的pCI2-Flag-YAP1-2δ重組質粒為模板，利用重疊PCR的方法刪去WW域的基因序列得到1δ基因片段。設計引物P5：5’-TTCTCTGGTTCATGGCTGAAGCCG AGTTCATC-3’；P6：5’-GATGAACTCGGCTTCAGCCATGAA CCAGAGAA-3’。以pCI2-YAP1-2δ為模板，分別用P1、P5和P2、P6進行PCR擴增，條件同2δ的片段擴增。通過DNA瓊脂糖凝膠判斷得到135 bp和763 bp的基因片段，分別純化回收，得到F4、F5兩個片段。按質量比1∶6的比例混合F4和F5作為雙模板，以P1和P2為引物進行第二次PCR擴增，PCR產物經DNA瓊脂糖凝膠電泳分析確定后純化回收，得到所需片段F6，大小為866 bp。同樣用ClaI和SalI兩個限制性內切酶對F6片段進行酶切，選取buffer3.1，室溫下過夜酶切，對F6片段進行酶切體系回收。將酶切回收的F6片段和上述的pCI2骨架片段進行連接，轉化，涂平板，挑單克隆，提質粒，進行酶切鑒定和測序。

1.2.5 重組質粒的蛋白表達：于6孔板內培養(yǎng)293細胞，當匯合度達到60%左右時，進行瞬時轉染。將Opti-MEM培養(yǎng)基分別與lipo2000、質粒混合孵育，再將其混合置于37 ℃培養(yǎng)箱內30 min使形成復合體。將復合物加至細胞內，4 h后換新的完全培養(yǎng)基，24 h后收蛋白。配膠，電泳，電轉，敷抗體，曝光。以轉染pCI2空載質粒為對照組，運用Western blot檢測2個重組質粒的蛋白表達情況。

2 結果

2.1 重疊PCR第一步產物 pCI2-Flag-YAP1-2γ經P1、P4和P2、P3兩對引物PCR擴增后，得到F1、F2片段，長度分別為438 bp和573 bp，見圖1A。pCI2-Flag-YAP1-2δ經P1、P5和P2、P6兩對引物PCR擴增后，得到F4、F5片段，長度分別為135 bp和763 bp，見圖1B。可作為第二步重疊PCR的模板。

圖1 YAP1-2δ先導片段（A）和YAP1-1δ先導片段（B）的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 目的片段YAP1-2δ和YAP1-1δ 分別以F1、F2和F4、F5片段為模板，進行第二步重疊PCR，得到目的片段YAP1-2δ（長度為980 bp）以及YAP1-1δ（866 bp）。見圖2。

圖2 YAP1-1δ和YAP1-2δ片段的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 pCI2-YAP1-2γ質粒載體 質粒載體pCI2-Flag-YAP1-2γ經瓊脂糖凝膠電泳后條帶見圖3。質粒經ClaI和SalI雙酶切后，DNA電泳可見4500 bp和1000 bp左右2條條帶，切取4500 bp左右條帶膠回收，用于后續(xù)連接使用。

圖3 pCI2-Flag-YAP1-2γ原質粒及酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 重組質粒雙酶切及基因測序 用EcoRI和SalI兩個限制性內切酶對重組質粒pCI2-Flag-YAP1-2δ和pCI2-Flag-YAP1-1δ進行雙酶切，分別顯示有4000 bp和1500 bp左右大小的條帶，與預期相符（見圖4A）。且測序結果比對正確（見圖4B-C）。重組質粒構建成功且無突變。

2.5 YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白表達 將重組質粒在293細胞中做瞬時轉染，以轉染pCI2-Flag空載質粒為對照?？梢奩AP1-1δ和YAP1-2δ蛋白表達量遠高于對照組（見圖5）。說明真核表達重組質粒構建成功且成功過表達蛋白。

圖4 重組質粒酶切鑒定（A）、YAP1-1δ測序結果（B）和YAP1-2δ測序結果（C）

圖5 重組質粒在293細胞中的蛋白表達

3 討論

Hippo信號通路最早在1995年于果蠅體內發(fā)現(xiàn)，是一條高度保守的信號通道。Hippo信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要的關系[11-12]。YAP1作為其重要的下游效應分子[13]，其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關[14-16]。研究表明，在肝癌、胃癌[17]、胰腺癌[18]、結直腸癌、宮頸癌、卵巢癌[19]等多種實體腫瘤中都不同程度的YAP1高表達。

在哺乳動物中，YAP1基因所轉錄的mRNA經過修飾后會翻譯出8種不同的YAP1蛋白，表明YAP1擁有8個亞型，它們的結構存在著顯著差異但又有一定的規(guī)律。這些結構上的差異可能就會對腫瘤的形成和發(fā)展產生不同的影響。YAP1的WW結構域可以與PPxY模體相結合。許多調節(jié)YAP1降解與核定位的調控蛋白，都含有PPxY模體，比如LATS1/2[20]、AMOT[21]、PTPN14等。那么WW域數(shù)量的不同就有可能影響YAP1和這些蛋白的結合，從而引起降解或通路的激活。除此之外，YAP1作為一個輔助轉錄因子，可以通過WW結構域與SMAD1[22]和ZEB1[23]結合，SMAD1和ZEB1是促進腫瘤細胞EMT進程的轉錄因子，增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力，那么YAP1與它們的親和力不同就會導致不一樣的腫瘤轉移能力。而現(xiàn)今并沒有研究報道YAP1各個亞型在生化特性和轉錄活性上的區(qū)別。

由于YAP1各個亞型在腫瘤細胞中的豐度很低，若想直接從cDNA中克隆獲取會耗時耗力，這也可能是為什么至今還沒有關于YAP1各個亞型的研究報道。而且YAP1基因片段較長，其5’端GC含量又很高，若直接PCR則很難獲得正確的基因片段，且錯配率會大大增加。所以本研究根據(jù)YAP1各個亞型間的結構差異，即刪除或增加特定的堿基，選擇通過重疊PCR的方法，先分別合成前后2段序列，這2段序列有部分重疊段，再進行第2次PCR讓這2段DNA結合并向兩端延伸得到所需目的片段。此方法可以在構建YAP1各個亞型中靈活運用，通過設計不同的引物，由一個亞型可衍生出其他亞型，大大減少工作量，降低錯配率，更加方便快捷。以pCI2-Flag-YAP1-2γ為模板，成功構建pCI2-Flag-YAP1-1δ和pCI2-Flag-YAP1-2δ兩個真核表達的重組質粒。并在細胞內成功表達YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白。這2個亞型間的區(qū)別就在于WW結構域的數(shù)量，這對于后續(xù)構建慢病毒載體質粒，以及研究轉錄因子與WW結構域的結合能力等提供了必要的條件，為找出具體是哪個YAP1亞型在腫瘤的形成和發(fā)展中起到關鍵作用奠定基礎。

參考文獻：

[1] SANDESC M, DINU A, ROGOBETE A F, et al. Circulating microRNAs expressions as genetic biomarkers in pancreatic cancer patients continuous non-invasive monitoring[J]. Clin Lab, 2017, 63(10): 1561-1566.

[2] CHEN Y, SHI Y, YAN H, et al. Timing of chemotherapy-induced neutropenia: the prognostic factor in advanced pancreatic cancer patients treated with gemcitabine/gemcitabine-based chemotherapy[J]. Oncotarget, 2017, 8(39):66593-66600.

[3] ZHANG W, NANDAKUMAR N, SHI Y, et al. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Sci Signal, 2014, 7(324): ra42.

[4] NGUYEN L T, TRETIAKOVA M S, SILVIS M R, et al.ERG activates the YAP1 transcriptional program and induces the development of age-related prostate tumors[J]. Cancer Cell, 2015, 27(6): 797-808.

[5] MELFIS, COLCIAGO A, GIANNOTTI G, et al. Stressing out the Hippo/YAP signaling pathway: toward a new role in Schwann cells[J]. Cell Death Dis, 2015, 6: e1915.

[6] CAO X, PFAFF S L, GAGE F H. YAP regulates neural progenitor cell number via the TEA domain transcription factor[J]. Genes Dev, 2008, 22(23): 3320-3334.

[7] PLOUFFE S W, HONG A W, GUAN K L. Disease implications of the Hippo/YAP pathway[J]. Trends Mol Med, 2015,21(4): 212-222.

[8] SUDOL M. YAP1 oncogene and its eight isoforms[J]. Oncogene, 2013, 32(33): 3922.

[9] SUDOL M. Newcomers to the WW domain-mediated network of the hippo tumor suppressor pathway[J]. Genes Cancer, 2010, 1(11): 1115-1118.

[10] 丁鑫, 孟剛, 童曉玲, 等. WW結構域與Hippo信號通路[J].蠶業(yè)科學, 2013, 39(6): 1177-1185.

[11] 李敏睿, 張盛洪, 鐘碧慧. Hippo信號通路在惡性腫瘤及干細胞中的作用[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2013, 22(4):389-392.

[12] 邱勤明, 石秋燕, 王江, 等. Hippo信號通路與腫瘤發(fā)生的研究進展[J]. 四川生理科學雜志, 2016, 38(1): 35-38.

[13] HALL C A, WANG R, MIAO J, et al. Hippo pathway effector Yap is an ovarian cancer oncogene[J]. Cancer Res, 2010,70(21): 8517-8525.

[14] 白帆, 劉小龍, 易俊, 等. Hippo通路與惡性腫瘤侵襲轉移的相關性研究進展[J]. 癌癥進展, 2016, 14(3): 213-216.

[15] 史夢婕, 邵松軍, 李潔媚, 等. Hippo通路與腫瘤相關性研究進展[J]. 中國細胞生物學學報, 2014, 36(3): 361-365.

[16] 吳卉, 花榮, 陳錦先. Hippo通路及靶因子Y A P與腫瘤關系的研究進展[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2013, 29(4): 515-517.

[17] 周廣璽, 張翠萍, 魏文超, 等. 慢性胃炎及微環(huán)境與胃癌[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2014, 29(2): 177-180.

[18] 王杰, 喻超, 周顯飛, 等. MiRNA-138-5 p抑制人胰腺癌細胞增殖能力[J]. 世界華人消化雜志, 2016, 24(28): 3970-3977.

[19] 周青峰, 羅慧, 朱雪瓊. Yes相關蛋白在婦科惡性腫瘤中的研究進展[J]. 溫州醫(yī)科大學學報, 2016, 46(7): 543-547.

[20] PAN D. The hippo signaling pathway in development and cancer[J]. Dev Cell, 2010, 19(4): 491-505.

[21] LEUNG C Y, ZERNICKA-GOETZ M. Angiomotin prevents pluripotent lineage differentiation in mouse embryos via Hippo pathway-dependent and -independent mechanisms[J].Nat Commun, 2013, 4: 2251.

[22] ARAGóN E, GOERNER N, ZAROMYTIDOU A I, et al. A Smad action turnover switch operated by WW domain readers of a phosphoserine code[J]. Genes Dev, 2011, 25(12):1275-1288.

[23] LEHMANN W, MOSSMANN D, KLEEMANN J, et al.ZEB1 turns into a transcriptional activator by interacting with YAP1 in aggressive cancer types[J]. Nat Commun,2016, 7: 10498.