孟云，馬俊偉，廖超，張凱莉，田會麗，糜唯鈺，姬華，王周平

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種革蘭氏染色陽性球形細(xì)菌，對生長沒有特殊的營養(yǎng)和環(huán)境要求[1]，在自然界中無處不在，廣泛分布于肉制品、牛奶和蛋類等食品中[2]，是常見的食源性致病菌，不僅能夠引起皮膚感染，還容易引起細(xì)菌性食物中毒。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生致病性腸毒素，最常見的是SEA～SEE 5種血清型，該毒素是一種高溫下很難消除的堿性蛋白，能夠引起嚴(yán)重的中毒癥狀。

涼皮是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷囊活惣词趁嬷破?，由于其水分活度高，營養(yǎng)豐富，且加工銷售條件粗放，極適于金黃色葡萄球菌的滋生和繁殖，造成二次污染[3]。微生物生長模型預(yù)測可以簡便、快捷、高效的判斷金黃色葡萄球菌生長的動態(tài)變化。目前，國內(nèi)外對金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測模型也做了大量的研究，F(xiàn)ujikawa等[4]和Juneja等[5]分別建立了牛奶、雞肉中金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測模型，Valero等[6]建立了金黃色葡萄球菌在不同溫度、pH、水分活度條件下的生長預(yù)測模型，但這些微生物生長預(yù)測模型絕大部分只針對肉制品[7]和乳制品[8]等食品，對涼皮這類即食面制品的研究較少。

因而本研究選用Baranyi模型、Modified Gompertz模型和Huang模型作為涼皮中金黃色葡萄球菌的一級生長模型，應(yīng)用Origin等軟件分別擬合金黃色葡萄球菌在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃和25 ℃的生長數(shù)據(jù)，并以此獲得μmax和λ。在此基礎(chǔ)上，采用平方根模型建立涼皮中金黃色葡萄球菌的二級生長模型，研究結(jié)果可為涼皮中金黃色葡萄球菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源、培養(yǎng)基及試劑

金黃色葡萄球菌菌株（KX023357.1)，石河子大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；胰蛋白胨大豆肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無菌均質(zhì)袋，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（分析純試劑），購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型潔凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS立式壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，紹興市蘇珀儀器有限公司；ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；BCD-216SDN型冰箱，青島海爾股份有限公司；Bag Mixer 400 VW型拍打式均質(zhì)器，法國INTERSCIENCE公司；電子天平等。

1.1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用涼皮均購自石河子市石河子大學(xué)北區(qū)小四涼皮店，涼皮加工成成品后，立刻采集，無菌操作采集樣品，并于2 h內(nèi)對樣品進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備與接種

將涼皮于滅菌鍋中滅菌后(121 ℃，20 min)置于無菌操作臺中冷卻后，每份涼皮樣品稱取10 g置于稀釋過的菌液中10 s，使初始接種量為102～103CFU/g，將接種后的涼皮樣品置于無菌均質(zhì)袋中，置于 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃和25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同的時間。

1.2.2 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)

到達(dá)預(yù)設(shè)的培養(yǎng)時間后，從培養(yǎng)箱中取出無菌均質(zhì)袋，將90 mL無菌生理鹽水加入均質(zhì)袋中并均質(zhì)2 min。將均質(zhì)液梯度稀釋后，菌落總數(shù)測定按照 GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》平板計(jì)數(shù)法[9]。

1.2.3 恒溫下涼皮中金黃色葡萄球菌的生長模型的建立1.2.3.1 一級生長模型的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的涼皮中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長數(shù)據(jù)，本文采用美國農(nóng)業(yè)部IPMP2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

Baranyi模型[10]：

(1)，(2)式中Y(t)、Y0和Ymax分別為t時刻的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))，初始時的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))和微生物達(dá)到穩(wěn)定時的最大數(shù)量(lg(CFU/g))，μmax為最大比生長速率(lg(CFU/g)/h)，h0為微生物的生理狀態(tài)。

Modified Gompertz模型[11]：

(3)式中 Y(t)、Y0和 Ymax分別為 t時刻的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))，初始時的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))和微生物達(dá)到穩(wěn)定時的最大數(shù)量(lg(CFU/g))，lag為遲滯期(h)，μmax為最大比生長速率(lg(CFU/g)/h)。e=2.72。

Huang 模型[12]：

(4)，(5)式中Y(t)、Y0和Ymax分別為t時刻的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))，初始時的微生物數(shù)量(lg(CFU/g))和微生物達(dá)到穩(wěn)定時的最大數(shù)量(lg(CFU/g))，μmax為最大比生長速率(lg(CFU/g)/h)，λ為延滯時間(h)，α為滯后相變系數(shù)：4.00。

1.2.3.2 二級生長模型的建立

二級模型描述了溫度對一級模型中金黃色葡萄球菌生長動力學(xué)參數(shù)的影響。

用平方根(Belehradek)方程描述效果簡單并且有效[13]，模型方程式如下：

(6)，(7)式中T是實(shí)驗(yàn)中的生長溫度(℃)；Tmin是理論上金黃色葡萄球菌生長的最低溫度；μmax為最大比生長速率(lg(CFU/g)/h)；λ是遲滯期(h)；b為常數(shù)。

1.2.4 模型的驗(yàn)證

根據(jù)相關(guān)系數(shù) R2，偏差因子 Bf，準(zhǔn)確因子 Af，標(biāo)準(zhǔn)差(S)，AIC(Akaike Information Criterion)和RMSE(Root Mean Squared Error)可判斷一級模型擬合程度的好壞。利用方差分析對二級模型預(yù)測效果進(jìn)行驗(yàn)證和評價(jià)[14]。

(8)，(9)式中 predicted為預(yù)測值，observed為實(shí)測值，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 涼皮中金黃色葡萄球菌的一級生長預(yù)測模型

圖1 Baranyi模型擬合得到的涼皮中金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.1 Growth curves of S. aureus in Liangpi derived from Baranyi model

采用Baranyi模型、Modified Gompertz和Huang模型，應(yīng)用美國農(nóng)業(yè)部的IPMP2013軟件分別對金黃色葡萄球菌在 5個溫度下的生長情況進(jìn)行擬合(見圖1、圖2和圖3)，并由此得到相應(yīng)的模型擬合參數(shù)(見表 1～6)。

圖2 Modified Gompertz模型擬合得到的涼皮中金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.2 Growth curves of S.aureus in Liangpi derived from modified Gompertz model

由表1～3可以看到：三種模型的R2值均大于0.96。Baranyi模型中，隨著溫度的升高，最大比生長速率逐漸增大，但10 ℃的最大比生長速率值小于5 ℃的最大比生長速率值。

圖3 Huang模型擬合得到的涼皮中金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.3 Growth curves of S. aureus in Liangpi derived from Huang model

Huang模型中，10 ℃的最大比生長速率值小于5 ℃的最大比生長速率值；隨著溫度的升高，遲滯期逐漸減小，Baranyi模型中，20 ℃的遲滯期小于25 ℃遲滯期；Huang模型中，20 ℃的遲滯期小于25 ℃遲滯期，只有Modified Gompertz模型擬合的數(shù)據(jù)符合這一生長規(guī)律。因此，綜合考慮，最終我們選用Modified Gompertz模型參數(shù)進(jìn)行二級模型擬合。

表1 Baranyi模型擬合的涼皮中金黃色葡萄球菌一級生長模型擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of primary growth model of S. aureus in Liangpi derived from Baranyi model

表2 Modified Gompertz模型擬合的涼皮中金黃色葡萄球菌一級生長模型擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of primary growth model of S.aureus in Liangpi derived from modified Gompertz model

表3 Huang模型擬合的涼皮中金黃色葡萄球菌一級生長模型擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of primary growth model of S.aureus in Liangpi derived from Huang model

表4 涼皮中金黃色葡萄球菌Baranyi方程的一級生長模型Table 4 Primary growth mode equation of S.aureus in Liangpi derived from Baranyi model

表5 涼皮中金黃色葡萄球菌Modified Gompertz方程的一級生長模型Table 5 Primary growth mode equation of S. aureus in Liangpi derived from modified Gompertz model

表6 涼皮中金黃色葡萄球菌Huang方程的一級生長模型Table 6 The primary growth mode equation of S.aureus in Liangpi from Huang model

2.2 涼皮中金黃色葡萄球菌的二級生長模型預(yù)測

本文主要考慮的是溫度對生長參數(shù)的影響，因此采用平方根模型作為二級模型，應(yīng)用Origin軟件分別對最大比生長速率、遲滯期與溫度的關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖4、5所示。擬合得到的方程為方程(10～11)。

圖4 溫度與最大比生長速率關(guān)系(Modified Gompertz)Fig.4 Relationship between temperature and maximum ratio of growth rate (Modified Gompertz)

圖5 溫度與遲滯期關(guān)系(Modified Gompertz)Fig.5 Relationship between temperature and lag phase(modified Gompertz)

由以上擬合結(jié)果來看，Modified Gompertz模型參數(shù)擬合得到的二級模型的R2值為0.80和0.88。且二級模型擬合的溫度與最大比生長速率關(guān)系為：

遲滯期與溫度的關(guān)系為：

R2均在 0.80以上，說明二級模型能較好地描述5～25 ℃范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌的最大比生長速率與遲滯期與溫度的關(guān)系。

2.3 模型的驗(yàn)證

一級模型經(jīng)AIC（Akaike Information Criterion，AIC是衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，AIC值越小越好）和RMSE（Root Mean Squared Error）驗(yàn)證，結(jié)果如表7所示。綜合來看Modified Gompertz模型優(yōu)于Baranyi模型和Huang模型。

表7 一級模型的AIC和RMSETable 7 AIC and RMSE of primary model

對建立的二級模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表8所示。

表8 二級模型方差分析結(jié)果Table 8 Variance analysis of secondary model

由表8可知，二級模型方程得到的P值均大于0.01小于0.05，說明方程顯著，所建模型在5～25 ℃范圍內(nèi)能較好地預(yù)測金黃色葡萄球菌在涼皮中的生長情況。

通常情況下金黃色葡萄球菌＞105CFU/g產(chǎn)生的腸毒素，可引起食物中毒，由圖1～3以及表1～3可知，涼皮在10 ℃、15 ℃、20 ℃和25 ℃下金黃色葡萄球菌達(dá)到105CFU/g的時間分別為96 h、36 h、16 h和9 h，而在5 ℃下其最大值不超過105CFU/g，小于金黃色葡萄球菌引起食物中毒的量，因此建議涼皮等即食食品的儲存或銷售盡量控制在5 ℃以內(nèi)，避免溫度過高使金黃色葡萄球菌產(chǎn)毒并引起食物中毒。

3 討論

金黃色葡萄球菌及其腸毒素造成的中毒事件已越來越受到重視，而影響金黃色葡萄球菌的生長和死亡因素有許多，溫度是其中最重要的因素之一。且溫度是最容易進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和及時調(diào)控的參數(shù)，因此通過建立金黃色葡萄球菌在涼皮中的生長預(yù)測模型進(jìn)行安全評價(jià)不僅操作簡單，預(yù)測及時，還能節(jié)約大量時間和費(fèi)用。

本試驗(yàn)中3種模型擬合的15 ℃、20 ℃、25 ℃的生長曲線效果比較好，而5 ℃、10 ℃擬合的生長曲線效果稍差，且擬合得到的一級模型和二級模型的 R2值均小于王亭亭，曹慧[3]等人報(bào)道的涼拌面中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型的值，可能是由于低溫條件下，金黃色葡萄球菌生長比較緩慢。

通常情況下金黃色葡萄球菌＞105CFU/g產(chǎn)生的腸毒素，可引起食物中毒，即食食品（涼皮、米皮和涼面）多在敞開或半敞開的環(huán)境下人工加工而成，且以散裝形式銷售，因此環(huán)境和加工人員對食品的污染為主要原因，且即食食品消費(fèi)者購買后不食用多在冰箱冷藏儲存，對450戶家用冰箱調(diào)查顯示，有44.8%的家用冰箱存在金黃色葡萄球菌的污染[15]，所以即使冰箱冷藏貯存，仍有一定的污染風(fēng)險(xiǎn)，一旦污染，金黃色葡萄球菌易在其中生長繁殖并產(chǎn)生腸毒素，則易引發(fā)食物中毒的發(fā)生。結(jié)合本文建立的預(yù)測模型，建議涼皮等即食食品銷售或儲存盡量將溫度控制在5 ℃以內(nèi)，避免引起食物中毒。

近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展，食品服務(wù)行業(yè)發(fā)展迅速，人們工作生活節(jié)奏越來越快，即食食品由于其食用方便、風(fēng)味獨(dú)特受到消費(fèi)者的廣泛青睞，成為居民日常生活的主要食品，而這類食品加工環(huán)境衛(wèi)生條件差，加工人員食品衛(wèi)生意識薄弱，加之運(yùn)輸、銷售過程的不衛(wèi)生加大了金黃色葡萄球菌污染食品的機(jī)會，使得在冷藏溫度下處于亞致死狀態(tài)的病原體，由于合適的生長條件而快速大量繁殖到危險(xiǎn)水平，使食用者感染的機(jī)會加大，因此即食食品是金黃色葡萄球菌食物中毒的高危食品，食品衛(wèi)生監(jiān)管部門應(yīng)當(dāng)高度重視此類食品的監(jiān)管，加大主動監(jiān)測力度的同時，加強(qiáng)食品加工環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)管，加強(qiáng)食品銷售環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)督，建立相對封閉的銷售場所并配以嚴(yán)格的消毒措施，對零售熟食制品以密封包裝而不是散裝形式進(jìn)行銷售，加強(qiáng)食品從業(yè)人員的健康監(jiān)管，加大消費(fèi)者的食品衛(wèi)生知識宣傳培訓(xùn)力度，可有效預(yù)防由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒的發(fā)生[16]。

今后可在恒溫模型的基礎(chǔ)上建立波動溫度下涼皮中金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測模型，以便能更好的預(yù)測波動溫度下涼皮在實(shí)際生產(chǎn)，加工，儲運(yùn)，銷售過程中金黃色葡萄球菌生長情況，本文旨在為涼皮中金黃色葡萄球菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

Modified Gompertz模型擬合得到的一級模型，其R2值都在0.96以上。說明Modified Gompertz模型能較好地?cái)M合金黃色葡萄球菌的生長。采用一級模型參數(shù)進(jìn)行二級模型擬合，模型擬合得到的最大比生長速率與溫度的關(guān)系為：

R2為0.80；遲滯期與溫度的關(guān)系為：

R2值為0.88，說明二級模型能較好地描述5～25 ℃范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌的最大比生長速率與遲滯期與溫度的關(guān)系。一級模型經(jīng) R2，Bf，Af，標(biāo)準(zhǔn)差(S)，AIC(Akaike Information Criterion)和RMSE(Root Mean Squared Error)驗(yàn)證，均在合理范圍內(nèi)，二級模型經(jīng)方差分析顯示方程顯著，說明所建模型在測試溫度范圍內(nèi)有效。由圖表可知涼皮中金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素的時間隨著溫度升高而逐漸減小，而在5 ℃下其最大值不超過 105CFU/g，小于金黃色葡萄球菌引起食物中毒的量，因此建議涼皮等即食食品的儲存或銷售盡量控制在5 ℃以內(nèi)，以免引起食物中毒。本實(shí)驗(yàn)為涼皮中金黃色葡萄球菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論依據(jù)。

致謝：感謝美國農(nóng)業(yè)部東部地區(qū)研究中心黃立漢博士及浙江大學(xué)丁甜博士對論文的指導(dǎo)。

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