劉寶亮，曹桂萍

（常州工學(xué)院數(shù)理與化工學(xué)院，江蘇常州 213002）

香樟樹又名木樟，屬于樟科類植物，主要分布在我國長江以南及西南地區(qū)，是國家二級重點保護野生植物，它在我國資源豐富。研究表明，香樟樹的各個部位都含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有捕獲游離基[1]、擴張腦血管[2]、抗菌抗病毒[3]和抗癌抗腫瘤[4]等功能。

離子液體，是指一般由有機陽離子和無機陰離子組成的在室溫條件下呈現(xiàn)液態(tài)的液體。離子液體的蒸汽壓幾乎為零、沒有揮發(fā)性、無色、無味；溫度范圍較穩(wěn)定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；對陰離子和陽離子的組成進行調(diào)節(jié)設(shè)計，可以形成多種不同性質(zhì)的離子液體，被稱為“設(shè)計者溶劑”，是一種新型的綠色溶劑[5,6]。Gutowski等[7]于 2003年首次提出了離子液體雙水相的概念，通過研究發(fā)現(xiàn)了水合磷酸鉀和親水性離子液體[Bmim]Cl可以形成離子液體為上相和磷酸鉀溶液為下相的雙水相體系。離子液體雙水相操作條件溫和，體系易于放大，耗能小。目前，離子液體雙水相萃取技術(shù)在生物分析[8~10]、藥物分析[11,12]以及天然有機物的提純[13~15]等方面有廣泛的應(yīng)用。

響應(yīng)面法設(shè)計方法(response surface methodology，RSM)最早是由數(shù)學(xué)家Box和Wilson于1951年提出來的，響應(yīng)面設(shè)計方法是利用合理的試驗設(shè)計方法并通過實驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。利用回歸方程作為函數(shù)估算的工具，將多因子試驗中因素與目標響應(yīng)值的關(guān)系用多項式擬合，將因子與目標響應(yīng)值的關(guān)系函數(shù)化，因而可對函數(shù)的響應(yīng)面進行分析，研究因子與目標響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進行優(yōu)化，得到最佳條件。它克服了正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析而不能給出直觀圖形的缺陷，響應(yīng)面設(shè)計方法得到了廣泛的應(yīng)用[16,17]。本文利用離子液體[Bmim]BF4雙水相技術(shù)，采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法，以香樟葉中黃酮類化合物提取率為考察指標，對香樟葉中黃酮類化合物的提取工藝進行研究，旨在為進一步研究香樟中黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性提供科學(xué)依據(jù)，為香樟葉的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

本論文采用萃取香樟葉中的黃酮類化合物，利用響應(yīng)面法優(yōu)化浸提條件。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

香樟葉，校園內(nèi)采集，烘干、粉碎備用；蘆丁標準品，[Bmim]BF4，硫酸銨，磷酸氫二鉀，亞硝酸鈉，硝酸鋁，鹽酸，氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1102紫外可見分光光度，上海大普儀器有限公司；CQ-250S超聲清洗儀器，上海吉理超聲儀器有限公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵，常州長城科工貿(mào)有限公司；FA1004型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；XH-MC-1實驗微波合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 四氟硼酸-1-丁基-3-甲基咪唑的制備

采用微波輻射兩步合成法，首先利用1-甲基咪唑和溴代正丁烷為原料，制備中間產(chǎn)物[Bmim]Br，然后再以丙酮為溶劑溶解[Bmim]Br，與硼氟酸鈉進行取代反應(yīng)，制備[Bmim]BF4。該實驗的加熱過程是間歇式加熱。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

圖1 不同蘆丁濃度的吸光度值Fig.1 The absorbency value of different rutin concentration

配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液50 mL，分別吸取0.0 mL，2.0 mL，4.0 mL，6.0 mL，8.0 mL，10.0 mL儲備液于25 mL容量瓶，加入1 mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，再加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加入4% NaOH溶液5 mL，加入60%乙醇定容至刻度，放置15 min，用分光光度計在510 nm處測定其吸光度。實驗結(jié)果見圖1。

由圖 1可知，該標準曲線的線性回歸方程為A=6.3937 C+0.0054，線性回歸系數(shù)R2=0.9994。

1.3.3 香樟葉的預(yù)處理

香樟葉于四月份采自常州工學(xué)院新北校區(qū)二號樓旁邊的落葉。將采集到的香樟葉浸泡10 min，洗凈除去泥土，于太陽下曬干，除去水分，并搗碎制成粉末放入干燥器中備用。取干燥后的香樟葉若干于密封的玻璃儀器內(nèi)，以原料比1:4向其中加入石油醚脫脂，脫脂時間25 min，用真空泵抽濾，除去石油醚，繼續(xù)加入石油醚脫脂，重復(fù)上述操作，共三次，將得到的香樟葉粉末放入小燒杯中，置于陽光下?lián)]發(fā)，除去其中的石油醚，裝入密封袋中備用。

1.3.4 香樟葉中黃酮的提取及測定

1.3.4.1 穩(wěn)定離子液體雙水相的確定

通過改變成相鹽的種類、成相鹽的加入量、離子液體與水的體積比，以黃酮化合物提取率為指標，確定穩(wěn)定高效離子液體雙水相的組成。

1.3.4.2 單因素實驗

分別以香樟葉的加入量、浸提時間、浸提溫度、溶液的pH這幾個因素做單因素試驗，考察各因素對香樟葉中黃酮類化合物提取效果的影響，以黃酮類化合物提取率為指標。

1.3.4.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，利用響應(yīng)面法比較各種影響因素的重要性，對影響因素進行比較，確定香樟黃酮化合物提取的最佳條件。

1.3.4.4 黃酮類化合物提取率的計算

黃酮類化合物提取液定容10 mL的容量瓶中，移取2 mL于25 mL容量瓶中，按上述標準曲線的方法測定，香樟中黃酮類化合物的提取率：

R-香樟葉中黃酮的提取率，%；C-溶液濃度，mg/L；m-香樟葉的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體（四氟硼酸-1-丁基-3-甲基咪唑）雙水相體系的確立

2.1.1 成相鹽的選擇對雙水相體系形成的影響

取6支10 mL的比色管，向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的去離子水，并向其中加入0.8 g的不同種類的鹽，包括 NaHSO4、NaCl、(NH4)2SO4、KH2PO4、Na2SO3、KCl，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，于室溫下放置15 min，分別比較不同鹽類對雙水相成相的影響，實驗結(jié)果見表1。

表1 鹽對雙水相體系成相的影響Table 1 Effects of salt on the phase formation of ionic liquid-aqueous two-phase system

由表1可知，NaCl、KH2PO4、KCl三種鹽無法與[Bmim]BF4形成雙水相，而 NaHSO4、(NH4)2SO4、Na2SO3可以與[Bmim]BF4形成雙水相，其中NaHSO4、Na2SO3雖然可以形成雙水相，但是溶解度較小，分相效果較差，而(NH4)2SO4溶解效果好，且有明顯分層，離子液體為上相，鹽為下相，且鹽用量很少，溶解也很快，在成相過程中會發(fā)生相轉(zhuǎn)移，因此就可以根據(jù)所要分離目標的需要，通過控制鹽的加入量改變離子液體雙水相的相比，以能夠更好地用于目標產(chǎn)物的純化與分離，所以本實驗選擇硫酸銨作為[Bmim]BF4體系的成相鹽。

由表1還可知，鹽能否與離子液體形成雙水相體系，與其包含的陰離子、陽離子都有關(guān)系，這可能是由于陰離子的水合導(dǎo)致其周圍分子的電子結(jié)構(gòu)緊縮，增強了水分子對半徑適當?shù)年栯x子的作用力，從而增強了鹽與水的聚合，使其表面張力發(fā)生變化，當其與離子液體的表面張力差達到一定程度，就會分相形成雙水相。

2.1.2 成相鹽的加入量對雙水相體系形成的影響

圖2 鹽的加入量對雙水相體系成相的影響Fig.2 Effects of adding amount of salt on the phase formation of ionic liquid- aqueous two-phase system

取10 mL的比色管5支，向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的去離子水，改變硫酸銨鹽的加入量，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置，待溶液出現(xiàn)明顯分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，上下?lián)u晃，充分混合均勻，在室溫條件下，靜置半小時，利用分光光度計測定吸光度，并計算出香樟葉黃酮的提取率，實驗結(jié)果見圖2。

由圖2可知，硫酸銨鹽的加入量在0.60~1.60 g時，鹽均能完全溶解并且形成明顯分層，雙水相澄清透明，分相迅速，鹽的加入量越大，富含離子液體的上相所占的體積比就越大。

當硫酸銨鹽的加入量從0.60 g增加到0.80 g時，黃酮的提取率不斷上升，硫酸銨鹽的加入量為0.80 g時，黃酮的提取率最高，達到 7.84%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著硫酸銨鹽的不斷加入，鹽與離子液體爭奪水分子，下相的離子液體減少，轉(zhuǎn)移至上相，而黃酮類化合物在離子液體中溶解度比較大，溶解在下相的黃酮類化合物上相，所以在硫酸銨質(zhì)量分數(shù)從0.60變化到0.80，總的黃酮提取率不斷增加。在硫酸銨鹽的加入量繼續(xù)增加時，黃酮的提取率趨于平穩(wěn)，但都低于0.80 g時的提取率，且硫酸銨鹽的加入量為1.50 g時，硫酸銨無法完全溶解于2 mL的去離子水中。可能是由于當加入的硫酸銨鹽過飽和時，在硫酸銨鹽不斷溶解、析出的過程中，部分黃酮類物質(zhì)會被其吸附，造成吸光度值減小，并且硫酸銨鹽的過飽和也會造成實驗藥品的浪費，所以本實驗鹽的加入量為0.80 g。

2.1.3 離子液體與水的體積比對雙水相體系的影響

取10 mL的比色管5支，分別向其中加入不同體積的離子液體和不同體積的的去離子水（1:3、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1），0.80 g的硫酸銨鹽，，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置15 min，待完全分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，搖晃均勻，于室溫下放置半小時，利用分光光度計測定其吸光度，并計算香樟葉中黃酮的提取率，實驗結(jié)果見表2。

表2 離子液體與水的體積比對黃酮提取率的影響Table 2 Effects of volume ratio of ionic liquid to water on the extraction rate of flavonoids

由表2可以看出，離子液體與水的體積比為2:2，2:3時可以形成雙水相體系，且體積比為2:2時，香樟葉中黃酮的提取率最大為 6.97%。而當離子液體與水的體積比為1:3和2:4時不能形成雙水相，當離子液體與水的體積比為2:5時，離子液體由上相變?yōu)橄孪?，體積比為2:1時加入的硫酸銨鹽無法完全溶解，會造成實驗藥品的浪費。離子液體質(zhì)量分數(shù)小時，由于無機鹽與水分子的締合作用使得加入的少量離子液體滯留其中，無法成相，之后隨著離子液體量的增多，滯留其中離子液體釋放出來，形成雙水相。離子液體富集在上相，黃酮類化合物離子液體中溶解度比較大，黃酮趨向于上相分配，離子液體質(zhì)量分數(shù)的增大，萃取率提高。且黃酮類化合物具有一定極性，離子液體和水的體積比為2:2時，萃取劑極性與黃酮類化合物相近，根據(jù)相似相溶的性質(zhì)，也有助于黃酮類化合物快速溶出。之后隨著離子液體質(zhì)量分數(shù)的再增加，溶劑極性占據(jù)主要因素，溶劑極性和黃酮類化合物極性相差越來越大，故而提取率降低。所以本實驗選擇的離子液體與水的體積比為2:2。

2.2 單因素實驗對黃酮提取率的影響

2.2.1 香樟葉的加入量對黃酮提取率的影響

圖3 香樟葉的加入量對雙水相體系成相的影響Fig.3 Effects of addition amount of camphor leaves on the phase formation of ionic liquid-aqueous two-phase system

取10 mL的比色管5支，向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的去離子水，0.8 g的硫酸銨鹽，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置15 min，待體系出現(xiàn)明顯分層，在向其中加入不同質(zhì)量的香樟葉粉末（0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g），于室溫條件靜置0.50 h，利用分光光度計測定吸光度，并計算香樟葉中黃酮的提取率，實驗結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出香樟葉的加入量從0.05 g增加到0.10 g，總黃酮類化合物的提取率不斷增加，加入量大于0.10 g，黃酮的提取率趨于水平，最大黃酮提取率為6.97%。加入的香樟葉太多，相對的提取溶劑比較少，固相主體溶度和液相主體溶度的溶度差比較小，這樣的結(jié)果是傳質(zhì)推動力比較小，有效成分流出速度慢，并且料液比太大加大過濾和純化困難，之后隨著比值的減小總黃酮提取率一直增加，到料液比 0.1 g處之后曲線趨于水平，萃取效果穩(wěn)定；并且實驗中是固定的雙水相的量，改變物料多少，一定的離子液體溶劑對黃酮的溶解度是一定的，所以在隨著香樟葉加入量增加的情況下，提取率得以提高，到香樟葉加入為0.1 g時，溶劑能全部溶解其中黃酮類化合物，所以之后香樟葉量增加，黃酮的提取率變化不大。但是料液比也不是越小越好，在雙水相體系中，料液比越小造成需要的分相鹽也增多，增加成本。故而在綜合考慮成本和提取效果這兩方面因素，選擇香樟葉加入量為0.10 g。

2.2.2 浸提時間對黃酮提取率的影響

取10 mL的比色管5支，向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的去離子水，并向其中加入0.80 g的硫酸銨鹽，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置15 min，待溶液出現(xiàn)明顯分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，搖晃均勻，于室溫條件放置不同的時間（0.50 h、1.50 h、2.50 h、3.50 h和4.50 h），利用分光光度計測定吸光度，并算出香樟葉中黃酮的提取率，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 浸提時間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著提取時間的增加，香樟葉中黃酮的提取率一直處于上升的趨勢，在1.50~3.50 h之間上升趨勢尤為明顯，因為在浸提初期細胞內(nèi)的黃酮物質(zhì)被釋放并擴散到離子液體中，隨著時間的增加黃酮的提取率逐漸增高。在3.50~4.50 h之間，黃酮的提取率沒有顯著變化，趨于平緩，4.50 h時的黃酮提取率達到10.32%，3.50 h的提取率在10.29%，兩者差別不大，表明時間超過3.50 h，黃酮的提取率已經(jīng)不會出現(xiàn)明顯變化，這是因為隨著浸提時間的逐漸增加，黃酮類物質(zhì)幾乎被全部釋放，黃酮的提取率也會隨之穩(wěn)定下來，所以為了節(jié)約實驗時間，提高實驗效率，本實驗選擇的浸提時間為3.50 h。

2.2.3 pH對黃酮提取率的影響

取10 mL的比色管5支，向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的不同pH值的B-R緩沖溶液（3、5、7、9、11），0.80 g的硫酸銨鹽，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置15 min，待雙水相分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，搖晃均勻，于室溫條件下放置3.50 h，利用分光光度計測定其吸光度，并計算出香樟葉中黃酮的提取率，實驗結(jié)果見圖5。

圖5 pH對黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of pH on the extraction rate of flavonoids

由圖5可以看出，pH在3~7之間變化趨勢很明顯，陡峭上升，pH 7~9之間變化幅度不是很大，并在pH=9時達到最大值，黃酮的提取率為8.54%，這是由于黃酮類物質(zhì)分子中含有游離酚羥基，可溶于堿性溶液中，并以酚羥基氧負離子的形式存在，隨著pH值的增加，鹽溶液中的負電荷逐漸增加，使得它對酚羥基氧負離子的排斥作用增強，黃酮不斷被轉(zhuǎn)移至上相，提取率不斷上升。當pH大于9，溶液堿性增強，黃酮提取率呈下降的趨勢，原因可能是因為堿性過強，破壞了黃酮母核，導(dǎo)致黃酮的萃取率降低；另外堿性太強，(NH4)2SO4水解，釋放氨氣，造成雙水相中鹽的含量減少，影響到雙水相的形成和雙水相的體積比，從而會導(dǎo)致黃酮提取率也會降低。綜上所述，溶液酸度為9時黃酮的提取率最大，所以本實驗選擇溶液酸度為9。

2.2.4 浸提溫度對黃酮提取率的影響

圖6 浸提溫度對黃酮提取率的影響Fig.6 Effects of the extraction temperature on the extraction

取10 mL的比色管5支，向其中加入2 mL離子液體，2 mL的pH=9的B-R緩沖溶液去離子水，0.80 g的硫酸銨鹽，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，靜置15 min，待完全分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，搖晃均勻，改變浸提溫度（30 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和90 ℃），分別放置3.50 h，利用分光光度計測定其吸光度，并計算香樟葉中黃酮的提取率，實驗結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，隨著溫度的升高，香樟葉中的黃酮提取率呈上升趨勢。在30 ℃~60 ℃之間，黃酮的提取率變化幅度不大，但是在60 ℃~70 ℃時上升很快，呈明顯的陡峭上升趨勢，但在70 ℃~90 ℃時提取率增加趨勢較為平緩，90 ℃時的提取率略大于70 ℃，提取率為10.49%。這是因為溫度升高可以降低溶劑的黏度，增高黃酮的溶解度，使得黃酮的有效成分迅速擴散，從而使得率增大；另一方面，當浸提溫度達到一定程度時可能對黃酮產(chǎn)生一定程度的破壞，使得黃酮損失，不利于提取，得率逐漸趨于平穩(wěn)。為了節(jié)約實驗時間，提高實驗效率，所以選擇的實驗浸提溫度為70 ℃。

2.3 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計(BBD)方案的確定

表3 Box-Benhnken試驗因子水平編碼表Table 3 Factor coding and levels of Box-Benhnken experiment

綜合單因素實驗結(jié)果，選擇浸提時間、浸提溫度以及溶液 pH值三個因素所確定的水平范圍，使用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，選擇Box-Behnken試驗設(shè)計，以黃酮的提取率為響應(yīng)值，進行三因素三水平共17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，各因素的編碼值與真實值見表 3。實驗以隨機次序進行，實驗結(jié)果見表4。

2.3.2 回歸模型分析

利用Design-Eepert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，建立二次多元回歸方程，對該方程的回歸分析與方差分析結(jié)果見各因素經(jīng)多元回歸擬合，得到回歸方程為：

Y=9.69+0.44A+0.35B+0.27C-0.16AB+0.5AC+0.57BC-0.65A2-0.095B2-0.43C2

由表5方差分析可以看出，模型p小于0.01，表明該模型方程極顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型相關(guān)系數(shù)R2為94.91%，大于90%，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型是合適的。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下黑花生衣中黃酮提取率的變化。由表5可知，對黃酮提取率作用顯著的是A、B、C、AC、BC、A2、C2，它們的p值分別為0.0017、0.0058、0.0200、0.0053、0.0027、0.0011、0.0098。由表5的p值可以知道，因素A、B、C對響應(yīng)值的線性效應(yīng)顯著，A2、C2對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)顯著，AC、BC對響應(yīng)值的交互影響顯著，AB對響應(yīng)值的交互影響不顯著。通過直接比較方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷因素影響的主次性。對香樟葉中黃酮提取率影響最大的是提取時間，其次是提取溫度，最后是溶液的pH。

表4 設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Design scheme and results

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Variance analysis of mathematical regression model

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

圖7 浸提時間和浸提溫度對黃酮提取率的交互作用圖Fig.7 The interaction of extraction time and extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

為了進一步考察3個試驗因子：提取時間（A）、提取溫度（B）及 pH（C）的交互作用以及確定最優(yōu)點，對回歸模型采用降維法分析，即可得到兩因子的回歸模型，并通過Design-Expert軟件繪制出響應(yīng)面曲線圖來進行直觀的分析。響應(yīng)面圖可以直觀地反應(yīng)出兩變量交互作用的顯著程度。極值條件出現(xiàn)在等高線的圓心處，等高線圖最圓，說明它們之間相互作用對香樟葉中黃酮的提取率的影響最大；而等高線圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小。圖7~9分別顯示了3組以香樟葉黃酮提取率為響應(yīng)值的趨勢圖。

圖8 浸提時間和pH值對黃酮提取率的交互作用Fig.8 The interaction of extraction time and pH on the extraction rate of flavonoids

圖7顯示浸提時間與浸提溫度對黃酮提取率的交互作用，隨著提取時間的延長和提取溫度的增大，香樟葉中黃酮的含量不斷上升，最后趨于穩(wěn)定；圖8顯示浸提時間與浸提溶液pH對黃酮提取率的交互作用，隨著提取時間的延長和溶液pH的增大，香樟葉中黃酮提取含量不斷上升，達到較高點后又緩慢下降；圖9顯示浸提溫度與浸提溶液 pH對黃酮提取率的交互作用，隨著提取時間的延長和溶液pH的增大，香樟葉中黃酮提取含量增加趨勢。綜合以上情況可以得出，浸提時間與浸提溫度、溶液pH之間交互作用均較顯著，浸提溫度與溶液pH間交互作用不明顯。

圖9 浸提溫度和pH值對黃酮提取率的交互作用Fig.9 The interaction of extraction time and pH on the extraction rate of flavonoids

通過Design-Expert 7.0軟件分析，建立了一個以香樟葉黃酮提取率為目標值，以浸提時間、浸提溫度和溶液pH為因子的數(shù)學(xué)模型。通過對回歸方程的優(yōu)化計算，得出最優(yōu)提取工藝條件為：浸提時間為3.7 h，浸提溫度為81.90 ℃，溶液酸度為9.59。考慮到實際操作的影響，將各因子進行修正：浸提時間為3.70 h，浸提溫度為82 ℃，溶液酸度為9.60。

取3支10 mL的比色管，向其中加入向其中加入2 mL的離子液體，2 mL的pH為9.60的緩沖溶液，0.80 g的硫酸銨鹽，震蕩搖晃，使溶液混合均勻，待溶液出現(xiàn)明顯分層后，向其中加入0.10 g的香樟葉粉末，搖晃均勻，于82 ℃條件下放置3.70 h，利用721 E分光光度計測定其吸光度，并計算香樟葉中黃酮的提取率，重復(fù)測定三次，得到黃酮的提取率分別為10.62%、10.65%和10.59%，三次平均值為10.62，回歸模型預(yù)測實驗值為10.58%，其相對誤差為0.38%，因此響應(yīng)面法對香樟葉中黃酮提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的黃酮提取條件具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

3.1 本實驗利用自制離子液體，確定了穩(wěn)定的離子液體雙水相體系為：離子液體為[Bmim]BF4，成相鹽為硫酸銨鹽，硫酸銨鹽的加入量為0.80 g，離子液體和水的體積比位2:2。

3.2 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立香樟葉中黃酮類化合物提取的二次多項式回歸模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠，能夠較準確的預(yù)測香樟葉中黃酮類化合物的提取率。最終考慮實際操作的便利性得出香樟葉中黃酮類化合物的最佳提取條件為：通過單因素實驗對香樟葉粉末的加入量、浸提溫度、浸提時間以及溶液酸度進行探討，得到最佳實驗條件為：0.10 g的香樟葉粉末，浸提時間為3.70 h，浸提溫度為82 ℃，溶液酸度為9.60，最優(yōu)條件下得到的黃酮最大提取率為10.62%，與預(yù)測值相符。響應(yīng)面優(yōu)化得到影響次序為：浸提時間>浸提溫度>溶液酸度。響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取工藝科學(xué)合理，準確可靠。

[1]Feng R Z, Wang Q, Tong W Z, et al. Extraction and antioxidant activity of flavonoids of Morus nigra [J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2015, 8(12): 22328-22336

[2]Lu W J, Lin K C, Liu C P, et al. Prevention of arterial thrombosis by nobiletin:in vitroandin vivostudies [J].Nutritional Biochemistry, 2016, 28(10): 1-8

[3]馬霞,郭振環(huán),劉永錄,等.納米蜂膠黃酮對豬細小病毒的體內(nèi)外抗病毒作用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2017,37(1):18-22,46 MA Xia, GUO Zhen-huan, LIU Yong-lu, et al. Anti-PPV activity of nanometer propolis flavone invetroandin vivo[J].Chin. J Vet. Sci., 2017, 37(1): 18-22, 46

[4]Kasala E R, Bodduluru L N, Barua C C, et al.Chemopreventive effect of chrysin, a dietary flavone against benzo (a) pyrene induced lung carcinogenesis in Swiss albino mice [J]. Pharmacological Reports Pr, 2016, 68(2): 310-318

[5]Seddon K R. Ionic liquids for clean technology [J]. Chem.Tech. Biotechnol., 1991, 68(7): 351-356

[6]Wilkes J S, Zaworotko M J. Air and water stable 1-ethyl-3-methyllimimdazolium based ionic liquid [J]. Chem.Soc. Chem. Commun., 1992, 13(2): 965-967

[7]Guowski K E, Broker G A, Willauer H D, et al. Controlling the aqueous miscibility of ionic liquids: aqueous biphasic systems of water-miscible ionic liquids and water-structuring salts for recycle, metathesis，and separations [J]. J. Am. Chem.Soc., 2003, 125(22): 6632-6633

[8]Capela E V, Quental M V, Domingues P, et al. Effective separation of aromatic and aliphatic amino acid mixtures using ionic-liquid-based aqueous biphasic systems [J]. Green Chemistry, 2017, 19(16): 1850-1854

[9]Mondal D, Sharma M, Quental M, et al. Suitability of bio-based ionic liquids for the extraction and purification of IgG antibodies [J]. Green Chemistry, 2016, 18(22): 6071-6081

[10]王偉濤,張海德,蔣志國,等.離子液體雙水相提取木瓜蛋白酶及條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(9):210-216 WANG Wei-tao, ZHANG Hai-de, JIANG Zhi-guo, et al.Extraction of papain by ionic liquid/aqueous two-phase system and optimization of process conditions [J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 30(9): 210-216

[11]Tan Z, Song S, Han J, et al. Optimization of partitioning process parameters of chloramphenicol in ionic liquid aqueous two-phase flotationusing response surface methodology [J]. Journal of the Iranian Chemical Society,2013, 10(3): 505-512

[12]Pereira J F B, Vicente F, Santos-Ebinuma V C, et al.Extraction of tetracycline from fermentation broth using aqueous two-phase systems composed of polyethylene glycol and cholinium-based salts [J]. Process Biochemistry, 2013,48(4): 716-722

[13]Santos J H, Ventura S P, Coutinho J A, et al. Ionic liquid-based aqueous biphasic system as a versatile tool for the recovery of antioxidant compounds [J]. Biotechnology Progress, 2015, 31(1): 70-77

[14]Mafalda R A, Passos H, Pereira M M, et al. Ionic liquids as additives to enhance the extraction of antioxidants in aqueous two-phase systems [J]. Separation and Purification Technology, 2014, 128: 1-10

[15]范杰平,曹婧,孔濤,等.[Bmim]Br-K2HPO4雙水相萃取與超聲耦合法提取葛根中的葛根素及其優(yōu)化[J].高校化學(xué)工程學(xué)報,2011,25(6):955-960 FAN Jie-ping, CAO Jing, KONG Tao, et al. Optimization of ultrasonic-assisted [Bmim]Br-K2HPO4aqueous two-phase system extraction of puerarin from pueraria [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2011, 25(6):955-960

[16]彭芳剛,李綺麗,吳衛(wèi)國.響應(yīng)面法優(yōu)化紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐奶崛」に囇芯縖J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(6):1349-1354 PENG Fang-gang, LI Qi-li, WU Wei-guo. Optimization of extraction of proanthocyanidins from skin of red locus seed using response surface methodology [J]. Modern Food Science and Technology, 2013, 29(6): 1349-1354

[17]Xingli Liu, Taihua Mu, Hongnan Sun, et al. Optimization of aqueous two-phase extraction of anthocyanins from purple sweet potatoes by response surface methodology [J]. Food Chemistry, 2013, 141(6): 3034-3041