宋培欽，劉鷺，魏東

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

巖藻黃素(fucoxanthin)是一種參與光合作用的類胡蘿卜素，占自然界總類胡蘿卜素的10%以上，廣泛存在于褐藻、硅藻和金藻等藻類中[1]。巖藻黃素在藻類細(xì)胞中與葉綠素和蛋白組合成一個FCP復(fù)合體，在光合作用的光捕獲、光能傳遞和光保護(hù)等生理作用中扮演重要的角色[2]。巖藻黃素具有一個區(qū)別于其他常見類胡卜素（如β-胡蘿卜素、番茄紅素和蝦青素等）的丙二烯結(jié)構(gòu)和5,6-環(huán)氧結(jié)構(gòu)（如圖1）。

圖1 巖藻黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of fucoxanthin

巖藻黃素具有很好的研究意義及很高的應(yīng)用價值。Peng J等[3]研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃素在抗癌、抗內(nèi)毒素炎癥、抗氧化、抗瘧疾以及保護(hù)肝臟、血管等有顯著的功效。另外，Kuipers R S等[4,5]研究證實了巖藻黃素能顯著改善胰島素抵抗特性，降低血液中葡萄糖含量，在減肥方面功效顯著。

目前用于提取巖藻黃素的原料主要為海帶、裙帶菜等大型海藻。然而由于大型海藻中巖藻黃素含量低、養(yǎng)殖成本高、提取純化困難且有季節(jié)性生長的特點，嚴(yán)重限制了巖藻黃素的開發(fā)利用[6,7]。Kim S M等[8]研究發(fā)現(xiàn)海洋硅藻中的巖藻黃素含量豐富，含量高達(dá)15.42～16.51 mg/g，是大型海藻的10倍以上。同時單細(xì)胞微藻具有生長速度快、易于培養(yǎng)和在生物反應(yīng)器中可人工調(diào)控的優(yōu)點，從而解決了工業(yè)化生產(chǎn)的原料問題。

三角褐指藻是一種海洋真核單細(xì)胞藻，其巖藻黃素含量是大型藻的數(shù)倍，且相對于大型藻類來說更易于提取分離[1,8]。同時三角褐指藻的生長速率較快，易于室內(nèi)或戶外規(guī)?；囵B(yǎng)。目前微藻養(yǎng)殖的方法和反應(yīng)器很多如：跑道池、光生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐等。跑道池易于排氧及規(guī)?；?，迄今為止90%的微藻商業(yè)化養(yǎng)殖，均采用跑道池[9,10]。本文選取三角褐指藻為實驗材料，探討在戶外跑道池條件下鹽度、pH值和氮源種類對三角褐指藻生長情況及巖藻黃素含量的影響，以期為三角褐指藻的戶外大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三角褐指藻（P. tricornutum）由中國科學(xué)院水生生物研究所胡晗華研究員惠贈；巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司；乙腈、乙酸乙酯、甲醇為色譜純試劑，丙酮、磷酸二氫鈉和硅酸鈉等均為分析純試劑；Instant Ocean海鹽購自Marineland；鹽度計（ATC）購自上海淋譽貿(mào)易有限公司；筆式pH計（MT-8062）購自 Exact Instrument；可見分光光度計（721）購自上海佑科儀器儀表有限公司；冷凍干燥機（Modulyod）購自Thermor Eletron Corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備

表1 f/2培養(yǎng)基Table 1 f/2 medium

表2 f/2微量元素溶液Table 2 f/2 trace metal solution

三角褐指藻種子液的制備分三步進(jìn)行，首先在250 mL的錐形瓶中（裝液量100 mL）培養(yǎng)至指數(shù)期，然后轉(zhuǎn)移到3 L的錐形瓶（裝液量1.5 L），最后擴種到18 L的PVC透明培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)。第一、二步培養(yǎng)在恒溫?fù)u床上進(jìn)行，培養(yǎng)溫度 20±1 ℃，光照強度4000±500 Lux；第三步培養(yǎng)時，需用空氣泵經(jīng)無菌濾膜泵入空氣，保證 CO2的溶解量，并增加光強至8000±500 Lux。接種前要對培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿進(jìn)行高溫高壓滅菌（121 ℃、20 min）和其他消毒處理。三角褐指藻的培養(yǎng)采用f/2人工海水培養(yǎng)基[11]（表1、2）。海水利用人工海鹽（Reef Crystals?，Instant Ocean Corp., VA, USA）進(jìn)行配置。

1.2.2 戶外培養(yǎng)及采收

圖2 開放池和超濾采收裝置Fig.2 Open pool and ultrafiltration recovery unit

三角褐指藻戶外培養(yǎng)階段主要包括由一級池到三級池的戶外培養(yǎng)以及采收工作。各級跑道池的底面積為：一級跑道2.5 m2；二級跑道池10 m2，三級跑道池40 m2，各級跑道池的培養(yǎng)水深均為20 cm。在戶外培養(yǎng)過程中每級跑道池的起始接種密度要達(dá)到OD450nm在0.2～0.3之間，接種時間一般選在早上光照不強的時間，接種以及培養(yǎng)過程中添加的培養(yǎng)基均采用 f/2人工海水培養(yǎng)基。戶外培養(yǎng)基用水為自來水，配置培養(yǎng)基之前經(jīng)過 0.5 μm 微孔濾膜過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，并用10-5的二氧化氯消毒。在每次使用培養(yǎng)池之前，使用5×10-5的二氧化氯對培養(yǎng)池進(jìn)行消毒，每次消毒時間12 h。

采收過程采用二級過濾采收模式，首先藻液通過20 μm的預(yù)過濾裝置除去藻液中較大的雜質(zhì)，再經(jīng)過0.5 μm的微濾膜組件來濃縮藻液，連續(xù)循環(huán)濃縮后達(dá)到預(yù)期濃度的藻液灌裝后冷藏備用。一級培養(yǎng)池及采收裝置見圖2。

1.2.3 三角褐指藻戶外生長過程的監(jiān)控

采用OD值法、血球計數(shù)法和干重法對三角褐指藻的戶外生長過程進(jìn)行監(jiān)控。

OD值法：吸取3 mL藻液置于石英比色皿中，在紫外分光光度計下測定450 nm條件下的光密度值。血球計數(shù)法：在顯微鏡下，通過計數(shù)獲得。干重法：吸取40 mL藻液置于已準(zhǔn)確稱量的50 mL康寧離心管中，6000 r/min離心10 min，所得藻泥用超純水進(jìn)行清洗后繼續(xù)進(jìn)行離心，重復(fù)兩次，得到的藻泥進(jìn)行冷凍干燥，然后用分析天平準(zhǔn)確稱量干燥后藻粉的最終質(zhì)量并計算差值。

通過細(xì)胞密度計算出不同培養(yǎng)條件下三角褐指藻的比生長速率μ/d。比生長速率計算公式：

1.3 實驗設(shè)計及處理

實驗室之前的研究成果表明：三角褐指藻在鹽度25、pH值8.0、尿素為氮源（含氮量1.76 mmol/L）的條件下其生長狀況最佳。本次戶外跑道池研究實驗中選用鹽度、pH值、氮源種類為主要影響因子（考慮到生產(chǎn)成本，氮源選用較為廉價的尿素和碳銨），探究其對三角褐指藻生長及巖藻黃素積累的影響。影響因子的濃度設(shè)計及氮源種類見表3。

表3 影響因子實驗設(shè)計Table 3 Experiment design of influence factors

實驗過程中，通過跑道池、CO2儲氣罐、pH檢測器和通氣管道來維持pH值的恒定。通氣管道的一端與儲氣罐相連，另一端伸入跑道池內(nèi)的藻液中，檢測器具有一根浸沒于藻液中的pH電極，通過電極檢測跑道池內(nèi)的藻液pH值，然后將測得的pH與檢測器所設(shè)定的閾值相比較，并形成閾值比較信號；通氣管道上具有電子通氣控制器能夠控制通氣管道的氣路通斷，電子通氣控制器與檢測器連接并可接收檢測器的閾值比較信號，并根據(jù)所接收的閾值比較信號控制電子通氣控制器，從而實現(xiàn)pH值的穩(wěn)定。實驗結(jié)束后，通過對細(xì)胞密度、OD值以及巖藻黃素的積累情況進(jìn)行分析對比，以確定戶外高密度培養(yǎng)三角褐指藻的最適宜條件。

1.3.1 鹽度對三角褐指藻生長及巖藻黃素積累的影響

鹽度優(yōu)化實驗在一級跑道池中進(jìn)行。培養(yǎng)基采用f/2人工海水培養(yǎng)基；碳銨為氮源（含氮量 1.76 mmol/L）；pH值8.0（通過通入CO2控制pH恒定）；設(shè)置A、B、C三池，鹽度分別為20、25和30；使用電機攪拌，攪拌速率80 r/min。保持接種密度相同。實驗時間在4月上旬。

1.3.2 pH值對三角褐指藻生長及巖藻黃素積累的影響

pH優(yōu)化實驗在一級跑道池中進(jìn)行。設(shè)置A、B、C三池，在接種密度相同的條件下，通過通入CO2分別控制培養(yǎng)基pH在7.5、8.0和8.5；培養(yǎng)基采用f/2人工海水培養(yǎng)基；碳銨為氮源（含氮量1.76 mmol/L）；選取最優(yōu)鹽度20；使用電機攪拌，攪拌速率80 r/min。實驗時間在4月中旬。

1.3.3 氮源對三角褐指藻生長及巖藻黃素積累的影響

氮源優(yōu)化實驗在一級跑道池中進(jìn)行。設(shè)置 A、B兩池，采用去除氮源的 f/2培養(yǎng)基，分別以尿素和碳銨為氮源（含氮量1.76 mmol/L）；選取最優(yōu)鹽度20，最優(yōu)pH值8.0，使用電機攪拌，攪拌速率80 r/min。實驗時間在4月下旬。

1.3.4 一個光暗周期中巖藻黃素含量的變化

在一級跑道池中，采用 f/2人工海水培養(yǎng)基；鹽度20；pH值8.0；碳銨為氮源（含氮量1.76 mmol/L）培養(yǎng)三角褐指藻。培養(yǎng)至穩(wěn)定期時，從第一天晚上 7點開始每三個小時取樣一次，一直持續(xù)到次日晚上 7時測定一天中三角褐指藻巖藻黃素含量的變化。實驗時間在4月下旬。

1.3.5 光照強度和溫度的測定

分別使用TES 132A光照強度測量計和酒精溫度計進(jìn)行光照強度和水溫的測定，每隔一個小時測定一次，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 巖藻黃素的提取分析

準(zhǔn)確稱取10 mg藻粉，裝入2 mL凍存管中，添加適量陶瓷珠。加入4 ℃丙酮提取液，每次添加量1 mL，用震蕩器在3800 r/min下，震蕩30 s。用液氮浸提5 min，離心收集上清液至15 mL離心管中，反復(fù)進(jìn)行多次，直至藻泥變成白色。合并所有上清液，用氮氣吹干離心管中有機溶劑。用色譜級丙酮定容至 1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，置于棕色進(jìn)樣瓶中。全過程保持色素溶液處于無光或短暫弱光中。

HPLC系統(tǒng)采用Waters雙1525泵和2996二極管陣列檢測器(Waters, MA, USA)，Waters Spherisorb?ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相由A液(乙腈/甲醇/0.1 M Tris-HCl，體積比為 84:2:14，pH 8.0)和B液（甲醇/乙酸乙酯，體積比為68:32）組成。梯度洗脫：從100% A線性變化到100% B，1～15 min；100% B，15～22 min；從100% B線性變化到100% A，22～25 min；100% A，25～30 min。流速為1.2 mL/min。進(jìn)樣量為20 μL。色素的吸收光譜從250 nm到700 nm，在其峰位置450 nm處測定巖藻黃素的含量[12]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microcal Origin 8.5 Software對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SD）給出（n=3）。采用t檢驗來確定各試驗組之間差異，p＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻色素的定性定量分析

圖3 250～700 nm波長掃描下巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖Fig.3 Spectrogram of the fucoxanthin standard at wavelength range of 250～700 nm

本研究檢測了三角褐指藻在不同條件下，不同生長階段的巖藻黃素含量。首先通過HPLC法，以巖藻黃素濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)建立不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與其峰面積的回歸曲線（線性回歸方程如表4）。

表4 巖藻黃素濃度（μg/mL）與峰面積的關(guān)系Table 4 The relationship between the fucoidin concentration(μg/mL) and the peak area

巖藻黃素標(biāo)品在250～700 nm波長下掃描的光譜圖見圖3。如圖3所示，三角褐指藻在450 nm處有最大吸收峰。

巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm條件下的HPLC光譜圖見圖4。如圖4所示，巖藻黃素的定性出峰時間在第8 min。

450 nm條件下三角褐指藻色素提取液的HPLC光譜圖如圖5所示。

圖4 450 nm下巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖Fig.4 HPLC spectrum of fucoxanthin standard at 450 nm

圖5 450 nm下三角褐指藻色素提取液的HPLC譜圖Fig.5 HPLC spectrum of P. tricornutum pigment extract at 450nm

通過HPLC光譜圖的出峰時間可以對三角褐指藻提取液中的巖藻黃素進(jìn)行定性的分析，通過峰面積及回歸曲線可以對三角褐指藻中巖藻黃素含量進(jìn)行一個定量的分析。

2.2 光照強度和溫度的變化情況

鹽度、pH和氮源優(yōu)化過程中的最高光照強度和最高溫度以及一個光照周期中的光照強度和溫度隨時間的變化如圖6所示。

圖6 光照強度和溫度隨時間的變化Fig.6 Light intensity and temperature change over time

由于三組優(yōu)化實驗分時段進(jìn)行，從圖6中可以看出，不同時間光照強度和溫度的變化存在較大差異。

由圖6a可以看出，鹽度優(yōu)化過程中的最大光照強度和最高溫度無顯著的波動性變化，最大光照強度基本維持在10000 Lux，最高溫度基本維持在20～25 ℃。由圖6b可以看出，pH優(yōu)化過程中的最高溫度無顯著的波動變化，基本維持在23～24 ℃；最大光照強度呈現(xiàn)出波動式的變化，在培養(yǎng)的第1 d、第4 d光照強度普遍偏高，在培養(yǎng)的第3 d最大光強僅為5000 Lux。由圖6c可以看出，氮源優(yōu)化過程中水溫及光照強度普遍偏高，最高水溫基本維持在26～28 ℃，最大光強基本維持在30000 Lux。由圖6d可以看出，在13時光照最強，并且在13時～19時，培養(yǎng)池的水溫普遍偏高，基本維持在27 ℃以上。

2.3 不同培養(yǎng)條件下三角褐指藻的比生長速率

戶外不同條件下三角褐指藻的比生長速率如表 5所示。

表5 不同條件下三角褐指藻的比生長速率Table 5 The specific growth rate of P. tricornutum under different conditions

2.4 培養(yǎng)基鹽度對三角褐指藻生長情況及巖藻黃素含量的影響

不同鹽度對三角褐指藻生長情況的影響如圖7a、7b、7c。如圖所示，隨著培養(yǎng)時間的變化，三角褐指藻的OD值、細(xì)胞密度、干重呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢。

圖7 不同鹽濃度下OD值（a）、細(xì)胞數(shù)（b）、干重（c）和巖藻黃素含量（d）的變化Fig.7 Effects of different salinity on the OD value (a), cell counts(b), dry biomass concentration (c) and the fucoxanthin content(d) of P. tricornutum

隨著培養(yǎng)液鹽度的增加，OD值、細(xì)胞密度、干重的增長有顯著性差異（p＜0.05）。實驗進(jìn)行到第3 d時，細(xì)胞進(jìn)入到指數(shù)增長期，細(xì)胞增長較快。在第5 d時，鹽度為20條件下的OD值、細(xì)胞密度、干重最大，分別為0.998、6.01×106/mL、177.78 mg/L；鹽度為25條件下次之，OD值為0.951、細(xì)胞密度為5.67×106/mL、干重為165.93 mg/L；鹽度為30條件下的細(xì)胞密度、OD值及干重最低，分別為0.921、5.36×106/mL、158.52 mg/L。如表5所示，在鹽度為20的條件下，三角褐指藻的比生長速率最高為0.157。

三角褐指藻對鹽度的適應(yīng)范圍較廣，在鹽度為9～92的范圍內(nèi)都能生存[13]。然而較高和較低的鹽度，都不利于三角褐指藻的生長，隨著鹽度的升高，其生物量呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢這可能是由于鹽度對細(xì)胞滲透壓、細(xì)胞膜的通透性等產(chǎn)生了影響。

不同鹽度對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響如圖7d所示。由圖7d可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，巖藻黃素含量呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢。穩(wěn)定期時不同鹽度條件下，巖藻黃素含量無顯著性差異（p＞0.05）。在鹽度為20條件下，巖藻黃素含量最高為18.65 mg/g。

從圖 6a可以看出培養(yǎng)過程中的最高光強基本維持在10000 Lux左右；最高溫度基本維持在20～24 ℃之間，光照強度和溫度都較適宜于三角褐指藻的生長和巖藻黃素的積累。因此三角褐指藻的生長及巖藻黃素含量呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢。

因此，鹽度為20的條件下，不僅適合三角褐指藻的生長，更有利于巖藻黃素的積累。

2.5 培養(yǎng)基pH值對三角褐指藻戶外生長情況及巖藻黃素含量的影響

從圖8a、8b、8c中可以看出，在起始兩天內(nèi)，不同pH條件下OD值、細(xì)胞密度及干重均呈現(xiàn)增長的趨勢。從實驗第3 d開始，三種pH值下的OD值、細(xì)胞密度及干重的增長速率發(fā)生了明顯的變化，pH值8.0下的OD值、細(xì)胞密度和干重增長迅速，最終OD值高達(dá)1.045、細(xì)胞密度為5.8×106/mL、166.39 mg/L；pH值8.5條件下的OD值、細(xì)胞密度及干重相對增長緩慢，最終 OD值達(dá)到 0.635、細(xì)胞密度為4.15×106/mL、干重為114.72 mg/L；而pH值為7.5條件下的OD值、細(xì)胞密度及干重則開始下降，最終OD值為 0.352、細(xì)胞密度為 1.75×106/mL、干重為 66.11 mg/L。培養(yǎng)結(jié)束后，pH 8.0條件下的生物量明顯高于pH 7.5和pH 8.5條件下的生物量（p＜0.05）。如表5所示，pH值在 8.0條件下，比生長速率最高，達(dá)到0.191。

海洋微藻的最適生長 pH值與海水相接近約為8.0，但不同藻種之間也具有差異性。陳峰等[14]研究指出pH值的變化會影響微藻細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、相關(guān)膜的結(jié)構(gòu)組成、滲透壓及藻細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，一旦偏離最適pH值，微藻的生長及體內(nèi)相關(guān)代謝活動會受抑制。吳偉偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)三角褐指藻的最適生長pH值是8.0，且與pH值7.5和8.5的差異性顯著。本實驗中三角褐指藻的最適生長pH值為8.0，這與之前的研究呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。

如圖8d所示，在培養(yǎng)周期內(nèi)，不同pH值條件下，巖藻黃素的含量呈現(xiàn)出一種波動式的變化。這可能是光照和溫度等其他因素共同作用得到的結(jié)果。從圖6b可以看出，培養(yǎng)過程中最高水溫維持在23～24 ℃，比較有利于三角褐指藻的生長；在光照較強的第4 d，巖藻黃素明顯的下降，而在光照強度較低的第2 d、第3 d、第5 d巖藻黃素含量都相對較高。和初始接種時相比，整體呈現(xiàn)出一個下降的趨勢。pH值為8.0的培養(yǎng)基下降的較少，巖藻黃素含量相對較高。

圖8 不同pH條件下OD值（a）、細(xì)胞數(shù)（b）、干重（c）和巖藻黃素含量（d）的變化Fig.8 Effects of different pH on the OD value (a), cell counts (b),dry biomass concentration (c) and the fucoxanthin content (d) of P. tricornutum

Huang C C等[16]研究發(fā)現(xiàn)在光照強度較低時，葉綠素a和其他捕光色素（葉綠素b、葉綠素c和巖藻黃素等）含量增加；在光照強度較高時，一些次級類胡蘿卜素（如β-胡蘿卜素、蝦青素和葉黃素）等起光保護(hù)作用的色素的含量會增加。本次實驗中，由于戶外光照強度的不斷變化，巖藻黃素含量呈現(xiàn)出波動式的變化，并且與之前的研究規(guī)律相同。研究表明在pH 8.0的條件下，巖藻黃素的含量相對較高，這可能由于偏離最適pH后，三角褐指藻胞內(nèi)相關(guān)代謝活動受抑制所造成的。

由此可以看出pH 8.0的條件下，不僅適合三角褐指藻的生長，更有利于巖藻黃素的積累。

2.6 培養(yǎng)基氮源的種類對三角褐指藻戶外生長情況及巖藻黃素含量的影響

如圖9a、8b和9c所示，與碳酸氫銨相比尿素對三角褐指藻生長的促進(jìn)效果更加顯著（p＜0.05），最終OD值為0.667、細(xì)胞密度為4.0×106/mL、干重為150.83 mg/L。從表5可以看出，以尿素為氮源三角褐指藻的比生長速率略高，為0.138。不同氮源對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響如圖9d所示。

圖9 不同氮源條件下OD值（a）、細(xì)胞數(shù)（b）、干重（c）和巖藻黃素含量（d）的變化Fig.9 Effects of different nitrogen sources on the OD value (a),cell counts (b), dry biomass concentration (c) and the fucoxanthin content (d) of P. tricornutum

從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的變化，巖藻黃素含量呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢。培養(yǎng)至第5 d時，碳酸氫銨中巖藻黃素含量明顯高于尿素中巖藻黃素含量，達(dá)到9.96 mg/g。從圖6c可以看出，氮源優(yōu)化過程中的光照強度相對較高，最高光強普遍達(dá)到 30000 Lux以上，并且溫度也相對較高，最高溫度基本維持在 26～28 ℃。

氮是微藻生長所必需的，同時也是藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸及色素合成的重要元素，對微藻的生長發(fā)育有著非常重要的作用。光照、溫度和氮源類型等對微藻的生長、油脂和色素的積累及多糖含量與脂肪酸組成也有著較為顯著的影響[17]。培養(yǎng)過程中巖藻黃素含量的下降可能與培養(yǎng)過程中較高的光照強度、溫度及氮源濃度等環(huán)境因素緊密相關(guān)。

三角褐指藻能利用銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、尿素態(tài)氮及其他無機氮源。氮源的種類、濃度都會對三角褐指藻的生長、巖藻黃素的積累產(chǎn)生影響。考慮到生產(chǎn)成本，本實驗選用經(jīng)濟實用的尿素和碳銨為氮源，得出尿素更有利于三角褐指藻的生長，碳酸氫銨更有利于巖藻黃素的積累。因此，以碳銨為氮源更有利于巖藻黃素的積累及生產(chǎn)。

2.7 一個光暗周期內(nèi)巖藻黃素含量變化

如圖10所示，一天中不同時刻巖藻黃素含量呈現(xiàn)出波動式的變化趨勢，巖藻黃素含量分別在晚上 10時，上午4時及下午4時，取得最大峰值。

在起始的19時～22時，巖藻黃素含量有一個明顯的上升。從圖6d可以看出，此時溫度明顯下降，較利于三角褐指藻的生長及巖藻黃素的積累。從 22時以后，由于氮源的缺乏，巖藻黃素含量整體呈現(xiàn)出下降的趨勢，并且在光照強度及溫度都相對較高的13時，達(dá)到最低值。

圖10 一個光照周期內(nèi)巖藻黃素含量變化Fig.10 Changes in the fucoxanthin content of P. tricornutum in a light cycle

3 結(jié)論

本研究表明，三角褐指藻在戶外開放式跑道池中，在鹽度為20、pH值為8.0、碳銨為氮源的環(huán)境中生長較快，巖藻黃素的含量較高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。此外，藻種采集可以選擇在晚上10時左右進(jìn)行，以獲得最大生物量和巖藻黃素含量。在今后的研究中，多個因素之間的交互作用，及交互作用下的最優(yōu)水平，以及戶外條件下對光強、溫度等的控制仍需要更深入的探究。

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