陳洪璋，李偉，肖蘇堯，曹庸，陳運嬌

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510180）（2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省天然活性物工程技術研究中心，廣東廣州 510642）

隨著自由基醫(yī)學和自由基生物學的發(fā)展，人們逐漸認識到生物體內(nèi)的自由基過高會起氧化脅迫，而氧化脅迫與癌癥、心血管病、衰老和其它退行性疾病相關[1]。抗氧化劑是能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對機體損害的一類物質(zhì)[2]，因此抗氧化劑的研究越來越熱門。然而，人工合成抗氧化劑如 BHT的使用常因產(chǎn)生一些副作用而受到質(zhì)疑[3]。所以尋找高效廉價的阻斷自由基反應的抗氧化劑的研究越來越重要，從天然資源中提取抗氧化活性物質(zhì)受到越來越多的關注[4]。

由于紙漿和紙張生產(chǎn)的巨大需求，桉樹在我國種植面積廣闊[5]。廣林9號桉樹是近年來新培育引種成功的新品種，屬于尾巨桉(Eucalyptus grandis×E.urophylla)，廣泛種植于廣東、廣西和海南等地，人工林種植面積達到500多萬hm2，每年桉樹葉的產(chǎn)量大約為兩萬多萬噸[6,7]。作為生產(chǎn)木材和紙張的主要副產(chǎn)品，大部分的桉葉被用作提取精油的原料，其余都未加利用，不僅浪費了大量資源，而且不利于環(huán)境保護。大量研究表明桉葉提取物具有很強的抗氧化活性，日本等國對桉葉抗氧化活性進行了大量研究，已經(jīng)開發(fā)出桉葉的抗氧化食品添加劑及桉多酚產(chǎn)品[8]。國內(nèi)主要對桉葉精油提取及成分分析進行了大量研究，對桉葉抗氧化物研究較少，而且對桉葉提取物起主要抗氧化作用的物質(zhì)仍然不清楚。本團隊前期研究也表明桉葉提取物具有很好的抗氧化活性，且已從廣林9號桉葉中提取到了13種具有抗氧化活性的化合物[9～12]，但仍還有許多組分待分離鑒定。為了系統(tǒng)地探究桉葉提取物的化學成分與應用，本文繼續(xù)對廣林9號桉葉中抗氧化活性成分進行分離純化鑒定并檢測其抗氧化活性，目的是從作為副產(chǎn)品的樹葉中回收有應用潛力的抗氧化物，以提高桉葉資源的開發(fā)和利用，減少對環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 試劑

提取、分離和純化溶劑為：乙醇，石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇和丙酮。抗氧化活性實驗溶劑為：DPPH（Sigma-Aldrich）。制備高效液相色譜和抗氧化活性實驗的溶劑均為分析純。用于分析高效液相色譜法的溶劑為高效液相色譜級。

1.2 桉葉抗氧化物的提取、分離及純化

廣林九號桉葉采于廣東省茂名市林業(yè)局，自然陰干后粉碎備用。將桉葉水洗干凈，置于室內(nèi)自然陰干。把干葉磨成粉末，過40～60目篩的桉葉粉末1 kg，加入20倍體積的70%乙醇溶劑，超聲波提取兩次，每次30 min，減壓抽濾，合并濾液，減壓旋轉蒸發(fā)溶劑后，用蒸餾水定容到1 L。

連續(xù)依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇和水等不同極性溶劑進行萃取，各種溶劑重復萃取5次。萃取物用減壓旋轉蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，冷藏備用。從本團隊前期研究[10]可得知，乙酸乙酯萃取物顯示出最強的清除能力，因此乙酸乙酯萃取物被用于進一步的分離。稱取20 g乙酸乙酯萃取物溶解于用800 mL蒸餾水中后上樣，分別以水、5%、10%、20%、30%和 95%的乙醇對桉葉乙酸乙酯組分進行洗脫分離，每個濃度洗脫5個柱體積，并將洗脫液收集在一起，得到的組分依次命名為：P0、P5、P10、P20、P30和P95不同組分。本團隊已經(jīng)分別從水、10%、20%、30%等組分分離純化鑒定到13種物質(zhì)[9～12]，因此本論文繼續(xù)對P95進行分離純化。

1.3 桉葉提取物的純化

1.3.1 分析液相分析方法

島津 HPLC儀（LC-10AT二元高壓梯度儀，SPD-10A紫外檢測儀）；色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；檢測波長210/270 nm，色譜洗脫條件0%～90%甲醇（含有0.2%乙酸）梯度洗脫1 h，流速為1 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.2 分析樣品準備

各分析樣品溶解于甲醇中，上樣前過濾(0.45 μm)。稱取定量分析樣品，加甲醇溶解，過0.45 μm微孔濾膜后。用微量進樣器精密吸取20 μL進行分析測定。

1.3.3 中壓反相硅膠分離純化方法

根據(jù)分析液相條件，對組分相對較純樣品進行反相硅膠分離，洗脫液為水，乙腈混合溶液。

1.3.4 制備液相條件

島津HPLC儀（LC-8A HPLC二元高壓梯度儀，SPD-10A紫外檢測儀）；色譜柱為島津Shim-pack ODS型 C18柱(250 mm×20 mm，5 μm)；檢測波長 210 nm/270 nm，色譜洗脫條件根據(jù)分析液相分析的最佳分離條件，流速為12～15 mL/min。

1.4 DPPH自由基清除能力的測定

參照凌關庭[13]、劉微微[14]等方法并做一定的修改。樣品溶解于水或甲醇，稀釋成將一系列濃度的溶液。取配好樣品溶液0.2 mL及1×10-4mol/L DPPH溶液3.8 mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，?17 nm波長下測定吸光度。根據(jù)下列公式計算每種提取液對DPPH自由基的清除率：

其中：As為加0.2 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb為0.2 mL提取液+3.8 mL溶劑（甲醇）后的吸光度；Ac為0.2 mL溶劑（甲醇）+3.8 mL DPPH溶液的吸光度。

根據(jù)回歸方程求出清除率達到50%時候的半清除率濃度即IC50。

1.5 清除 ABTS+·能力測定

參照朱玉昌[15]、仇菊[16]和Miller[17]的方法做適當修改。充分混合5 mL的7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L過硫酸鉀后使其在室溫黑暗處反應12～16 h以制得ABTS自由基儲備液。然后用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)稀釋反應液制得在734 nm處吸光度為0.70±0.02的ABTS工作液。10 μL不同濃度化合物的甲醇溶液與96孔板中200 μL工作液混合均勻并于黑暗條件下反應6 min，然后讀取734 nm波長下吸光度A。

其中，A1是化合物混合液吸光度，A0為對照組混合液吸光度。

結果用不同清除速率的線性回歸方程得到的半清除率濃度IC50(μM)表示。

1.6 總抗氧化能力指數(shù)（ORAC）法抗氧化指數(shù)測定

參照 Wolfe[18]方法并做適當修改。簡單來說，分別將已溶于75 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4，緩沖液）的對照、Trolox標準液或樣液（50 μL）加入到黑色光滑的96孔板中，每個樣品重復3個孔。接著把100 μL的8×10-3mmol/L熒光素（緩沖液制備）加入到混合液中，然后在37 ℃下放置10 min，定期振蕩。最后把現(xiàn)配好的50 μL 153 mmol/L ABAP（緩沖液制備）加入混合液中，立即將96孔板放置到酶標儀中反應。反應條件為：溫度37 ℃，發(fā)射波長514 nm，激發(fā)波長490 nm，每1.5 min測定一次，直至熒光值衰減至直線，每次讀數(shù)前振蕩數(shù)秒。

按式(2)計算熒光衰退曲線下的面積(AUC)、式(3)計算保護面積(Net AUC)，以Trolox溶液濃度為橫坐標，以NetAUC為縱坐標，繪制曲線。最終ORAC值以每毫克化合物等同于Trolox的微摩爾數(shù)（平均值±標準差）來表示。

AUC=0.5×[2×(A0+A1+…+An-1+An)-A0-An]×Δt (2)

Net AUC=AUCSample - AUCblank (3)

1.7 核磁共振分析

核磁共振用美國Varian INOVA儀器進行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有結果表示為均值±誤差（n=3）。所有實驗重復3次。數(shù)據(jù)用單向方差分析(p＜0.05) (SPSS 13)。

2 結果與討論

2.1 桉葉乙酸乙酯萃取物 P95組分的液相分析

圖1 P95組分在不同條件下洗脫液相分析圖譜Fig.1 Analytical RP-HPLC chromatogram of P95 under different conditions

本團隊前期研究已從尾巨桉（Eucalyptus grandis×E.urophylla）廣林9號桉葉乙酸乙酯萃取物中的洗脫組分 0%乙醇、5%乙醇、10%乙醇、20%乙醇和30%乙醇等中分離純化到?jīng)]食子酸、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、英國櫟鞣花素、水楊梅丁素和特里馬素Ⅰ等抗氧化物[9～12]。為了進一步探究桉葉抗氧化成分，回收有應用潛力的抗氧化物，本論文繼續(xù)對95%乙醇洗脫組分（P95）進行分離純化。

首先采用乙腈與 0.2%磷酸水體系來優(yōu)化 P95組分的液相分析條件，分別用12%、15%和18%的乙腈等度洗脫，結果如圖1。乙腈與0.2%磷酸水體系等度洗脫可有效使P95組分分離，為了節(jié)省時間，選用18%的乙腈等度洗脫作為P95組分的液相洗脫條件。

2.2 桉葉乙酸乙酯萃取物 P95組分的中壓反相硅膠分離純化

采用中壓反相硅膠對P95組分進一步分離純化，采用乙腈與水體系，按0～25 min 20%乙腈，25～118 min 25乙腈，118～158 min 50%乙腈來進行梯度洗脫。

圖2 P95組分中壓反相硅膠洗脫組分Fig.2 The different fractions of P95 by medium-pressure silica gel column chromatography

圖3 P95組分經(jīng)中壓反相硅膠分離后的不同洗脫組分的液相分析圖譜Fig.3 Chromatogram of analytical RP-HPLC of different fraction scollected when P95 injected through hmedium-pressure silica gel column chromatography

洗脫液收集如下，將洗脫液旋轉蒸發(fā)濃縮冷凍干燥，得到不同洗脫組分，并依次命名為：P95-1、P95-2、P95-3、P95-4、P95-5和P95-6組分（圖2）。接著將過中壓反相硅膠各分離組分進行HPLC分析，結果如圖3。因此，反相硅膠對P95組分有一定的分離效果，且分離后，所得各組分峰較少，所得組分成分比較簡單。

2.3 P95-3、P95-4及P95-5組分的分離純化及鑒定

2.3.1 P95-3組分分離純化

圖4 P95-3組分制備液相圖譜及制備后峰1的分析圖Fig.4 Preparative RP-HPLC chromatogram of P95-3 and the peak 1 in P95-3 after preparation

從圖3可以看出，P95-3組分成分較少，因此對其進行制備液相分離。根據(jù)分析液相條件及圖譜確定制備液相分離條件為：檢測波長 270 nm，流速 15 mL/min。

根據(jù)分析液相圖譜，選擇13.8%乙腈等濃度洗脫，進樣量1 mL，進樣質(zhì)量為100 mg，按照峰收集，制備液相圖譜如下，收集峰，得到峰1組分，記為化合物A（圖4）。

2.3.2 95-4組分分離純化

從分析液相圖譜可以看出，P95-4組分成分較少，因此可以對其進行制備液相分離，再進行結構鑒定。根據(jù)分析液相條件及圖譜確定制備液相分離條件為：檢測波長270 nm，流速15 mL/min，根據(jù)分析液相圖譜，選擇13.5%乙腈等濃度洗脫，進樣量1 mL，進樣質(zhì)量為101 mg，按照峰收集，制備液相圖譜如下，收集峰，得到峰1組分，記為化合物B（圖5）。

圖5 P95-4組分制備液相圖譜及制備后峰1的分析圖Fig.5 Preparative HPLC chromatogram of P95-4 and peak 1 in P95-4 after preparation

2.3.3 95-5組分分離純化

圖6 P95-5組分制備液相圖譜、制備后峰1和制備后峰2的分析圖Fig.6 Preparative HPLC chromatogram of P95-5 and peak 1 and peak 2 in P95-4 after preparation

從分析液相圖譜可以看出，P95-5組分成分較少，因此可以對其進行制備液相分離，再進行結構鑒定。根據(jù)分析液相條件及圖譜確定制備液相分離條件為：檢測波長270 nm，流速15 mL/min，根據(jù)分析液相圖譜，選擇13.8%乙腈等濃度洗脫，進樣量1 mL，進樣質(zhì)量為35 mg，按照峰收集，制備液相圖譜如下，收集峰，得到峰1和峰2組分，分別記為化合物C和D（圖6）。

2.4 P95組分分離純化化合物的結構鑒定

2.4.1 P95-3組分中化合物A的結構鑒定

化合物 A為黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應顯紅色，示其可能為一黃酮類化合物。

圖7 各物質(zhì)的化學結構圖Fig.7 The chemical structures of the compounds

在其氫譜中，δH 6.21(1H，d，J=1.8 Hz)和6.40(1H，d，J=1.8 Hz)顯示為黃酮A環(huán)6位和8位質(zhì)子（間位耦合）；δH 7.83(1H，d，J=2.4 Hz)、6.87(1H，d，J=8.4 Hz)和7.58 (1H，dd，J=2.4，8.4 Hz)顯示為典型的黃酮B 環(huán) 3’，4’二取代特點，其中δH 7.83、6.87和 7.58分別歸屬為 2’、5’、6’位；δH 5.15(1H，d，J=7.8 Hz)顯示分子中還存在一糖分子，化合物A為一典型的黃酮苷類化合物。分析化合物的碳譜，δC 105.5、73.2、75.1、70.0、77.2、62.0進一步確證其糖分子為一六碳糖。另外其氫譜中給出δH 3.85(1H，d，J=2.4 Hz)及其他耦合常數(shù)信息，確定該糖不是葡萄糖而是半乳糖，由δH 5.15的耦合常數(shù)為7.8 Hz，說明為一β-D-半乳糖苷。將碳譜中碳部分信號扣除，還剩15個碳信號，并以上數(shù)據(jù)和陳躍龍等[19]報道的槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷的碳譜數(shù)據(jù)比較，完全一致，故鑒定化合物A為金絲桃苷，化學結構式如圖7a。

2.4.2 化合物B組分結構鑒定

黃色粉末，HCl-Mg粉反應陽性，molish反應陽性，示化合物為一黃酮苷類化合物，該化合物酸水解檢出阿拉伯糖和槲皮素。1H-NMR(DMSO-d6)：δ12.64(1H，S)示有 5-OH；9.2、9.8、10.9 (各 1H，S)示分子中還有三個酚羥基；7.65 (1H，d d，J=2.4，8.4 Hz)，7.50(1H，d，J=2.4 Hz)，6.84(1H，d，J=8.4 Hz)，示黃酮母核B環(huán)為3′，4′二取代；6.39(1H，d，J=2.4 Hz)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz)示A環(huán)為5，7二取代；5.27(1 H，d，J=4.8 H)示糖的端基質(zhì)子。13C-NMR(DMSO-d6)在δ101.4，71.6，70.7，66.0，64.2，共振信號示該化合物為一五碳糖苷，這些數(shù)據(jù)與甲基α-L-阿拉伯吡喃糖苷化學位移基本一致，其它碳共振信號與槲皮素13C-NMR譜數(shù)據(jù)比較，C-2向低場位移約10×10-6，C-3向高場位移約 3×10-6，示化合物苷元為槲皮素，且3-OH成苷，通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)其與文獻報道的槲皮素3-O-α-L阿拉伯吡喃糖苷一致，即番石榴苷，因此確定化合物B為番石榴苷[20]化學結構式如圖7b。

2.4.3 化合物C和D的結構鑒定

化合物C因含量太少未能鑒定其結構。化合物D為黃色粉末，HCl-Mg粉反應陽性，molish反應陽性，示化合物為一黃酮苷類化合物，該化合物酸水解檢出沒食子酸、阿拉伯糖和槲皮素。1H-NMR(DMSO-d6)：δ12.64 (1H，S)示有5-OH；9.2、9.8、10.9 (各1H，S)示分子中還有三個酚羥基；7.65 (1H，d d，J=2.4，8.4 Hz)，7.50(1H，d，J=2.4 Hz)，6.84(1H，d，J=8.4 Hz)，示黃酮母核B環(huán)為3’，4’二取代；6.39(1H，d，J=2.4 Hz)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz)示A環(huán)為5，7二取代；5.27(1 H，d，J=4.8 H)示糖的端基質(zhì)子。13C-NMR(DMSO-d6)在δ101.4，71.6，70.7，66.0，64.2，共振信號示該化合物為一五碳糖苷，這些數(shù)據(jù)與甲基α-L-阿拉伯吡喃糖苷化學位移基本一致，其它碳共振信號與番石榴苷13C-NMR譜數(shù)據(jù)比較，C-2”向低場位移約 1.9×10-6，C-3”向高場位移約 2.5×10-6，根據(jù)?；灰埔?guī)律，判斷沒食子酰基連在阿拉伯糖的C-2”位上。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)該波譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物D為槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽，化學結構式如圖7c。

2.5 分離鑒定化合物抗氧化活性研究

天然抗氧化物成分復雜，抗氧化作用機制無法用單一機制解釋，因此常常需要用兩種或兩種以上抗氧化活性評價方法，本文采用DPPH·、ABTS+·和ORAC等化學抗氧化方法來測定金絲桃苷、番石榴苷和槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽等化合物的抗氧化活性。

圖8 各化合物清除DPPH自由基的IC50值Fig.8 IC50 values of the compounds against DPPH radicals

2.5.1 DPPH自由基清除能力測定0.01～0.16 mg/mL之間清除DPPH自由基有較佳的劑量效應線性關系。半清除率濃度IC50越高，其抗氧化活性越低，因此各樣品清除DPPH自由能力為番石榴苷＞金絲桃苷＞槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽＞Trolox。3種抗氧化物均高于對照組維生素E水溶性類似物Trolox的清除能力。

2.5.2 ABTS+·自由基清除能力測定

圖9 各化合物清除ABTS自由基的IC50值Fig.9 IC50 values of the compounds against ABTS radicals

在 ABTS+·自由基清除能力方法中，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度越高，其清除率越高，抗氧化活性越強。由圖 9可知，各組樣品濃度在 0.01～0.15 mg/mL之間清除ABTS+·自由基有較佳的劑量效應線性關系，其中金絲桃苷清除 ABTS+·自由基的 IC50最低（136.64 μM）。相同濃度下各樣品清除ABTS自由能力為金絲桃苷＞槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽＞番石榴苷＞Trolox。因此3種抗氧化物均高于對照組維生素E水溶性類似物Trolox的清除能力。

2.5.3 ORAC法抗氧化指數(shù)測定

圖10 各化合物ORAC值比較Fig.10 Comparison of ORAC values of the compounds

由圖10可以看出，金絲桃苷、番石榴苷及槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽均有較強的抗氧化能力指數(shù)（ORAC）。相同當量的番石榴苷相當于Trolox的5.50倍ORAC值，其中番石榴苷＞金絲桃苷＞槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽＞Trolox。

總之，與Trolox相比，3種化合物均顯示更強的氧化能力，有著廣闊的應用前景。在DPPH·和ORAC方法中，3種化合物的抗氧化能力大小一致，番石榴苷的抗氧化能力最強，槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽的抗氧化能力最低。而在ABTS·+方法中金絲桃苷的抗氧化能力最強，番石榴苷的抗氧化能力最低。在不同方法中活性大小不大一致這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能有三個：第一，不同化合物對3種自由基的清除能力不同；第二，化合物對3種自由基的清除速率也可能不一樣。第三，各評價方法反應機理不盡相同。

3 結論

3.1 為進一步探索桉葉提取物抗氧化活性的物質(zhì)基礎，本文采用反相硅膠和制備液相等方法對桉葉提取物中高醇組分進行分離純化得到4個化合物，確證了其中3個化合物，分別為金絲桃苷、番石榴苷和槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽。另外 1個化合物還有待進一步鑒定。

3.2 采用DPPH·、ABTS·+和ORAC等化學抗氧化方法確定了金絲桃苷、番石榴苷和槲皮素-3-O-α-吡喃阿拉伯糖-2”-棓酸鹽等3種化合物比Trolox等抗氧化物的清除能力強，是有較好發(fā)展前景的天然抗氧化劑。

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