胡靜 鄭璐 張歡樂 張三典 陸妙珍 徐國棟 李旎 葉爽

2015年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示肺癌仍是中國發(fā)病率和死亡率居于首位的惡性腫瘤[1]。雖然近年來基礎研究和臨床治療技術(shù)突飛猛進，但是肺癌死亡率仍居高不下，2015年因肺癌死亡的患者高達70萬。免疫治療是目前興起的一種治療肺癌的手段[2]，尋求合適的治療靶點和免疫標志物成為研究的熱點[3]。傳統(tǒng)理論一直認為放療是通過損傷腫瘤的脫氧核糖核酸達到治療腫瘤的作用。然而近期研究表明，放療可以通過影響特定的免疫調(diào)節(jié)機制來發(fā)揮抗腫瘤效應[4]。尤其是當與免疫治療聯(lián)用時，可以提高免疫治療的療效[5]。Hald等[6]報道CD4+和CD8+共表達是可切除的、術(shù)后行輔助放療的肺癌患者的獨立預后指標。鑒于放療與腫瘤特異性免疫反應的潛在關(guān)聯(lián)，本文旨在探討CD4＋、CD8＋T淋巴細胞表達對術(shù)后行輔助放療的非小細胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）患者的預后意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集本院2011年3月至2014年3月行手術(shù)切除且術(shù)后放療的NSCLC患者385例。納入標準：年齡在18歲及以上；經(jīng)手術(shù)切除后的標本病理證實為NSCLC；近期未接受任何激素或免疫抑制劑治療；5年內(nèi)無第二原發(fā)腫瘤；有術(shù)后放療指征（切緣陽性或pN2患者），放療期間未行同步化療或靶向治療。最終符合標準46例，其中男 30例，女16例，年齡 44～74（54±6）歲；鱗癌16例，腺癌30例；按美國癌癥聯(lián)合委員會（American joint committee on cancer,AJCC）分期（第7版）標準：ⅡA期5例，ⅡB期7例，ⅢA期34例。

1.2 方法

1.2.1 放療方法 采用德國西門子公司生產(chǎn)的Primus.h直線加速器實施放療，采用累及野，予6MV或10MV X線照射。部分患者采用普通放療，對原發(fā)灶、同側(cè)肺門及縱隔進行垂直照射，每次200cGy，每周5次，當劑量達到40Gy/20f后縮野，調(diào)整照射野角度避開脊髓至治療劑量。部分患者采用調(diào)強放射技術(shù)（Intensity modulated radiation therapy,IMRT），勾畫瘤床及相應轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)引流區(qū)為臨床靶區(qū)（CTV），CTV外擴0.5～1cm為計劃靶區(qū)（PTV）。對于周圍正常器官如食管、正常肺組織、心臟、脊髓等給予限量，放療劑量為50～66Gy，2Gy/次，1 次/d，每周 5次，共 6～7周。

1.2.2 標本采集 每例病例分別選用1份含有腫瘤細胞的蠟塊和腫瘤邊緣的間質(zhì)組織蠟塊制作標本，采用距離原發(fā)肺腫瘤3cm的正常肺組織做成的蠟塊作為對照，由2位病理醫(yī)生確認入選。

1.2.3 免疫組化及量化分析 兔抗人CD4（BM4379，0.2ml）、CD8（BM4263，0.2ml）免疫組化單克隆抗體（工作濃度 1∶50）、二抗（BA1011，0.1ml）、即用型 SABC-AP試劑盒（SA1054）均購于武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化流程及具體方法按照試劑盒所提供的操作執(zhí)行。免疫組化結(jié)果的量化通過光學顯微鏡（Olympus，BX53）分析特定免疫細胞被染色浸潤的程度來計算。CD8＋T淋巴細胞的量化標準：（1）腫瘤組織：上皮細胞浸潤＞5%的為高表達，浸潤≤5%為低表達，細胞未染色為無表達；（2）間質(zhì)組織：細胞核表面浸潤＞50%的為高表達，核表面浸潤≤50%為低表達，核未染色為無表達。CD4＋T淋巴細胞的量化標準：（1）腫瘤組織：上皮細胞浸潤≥5%的為高表達，浸潤＜5%為低表達，細胞未染色為無表達；（2）間質(zhì)組織：細胞核表面浸潤≥25%的為高表達，核表面浸潤＜25%為低表達，核未染色為無表達。

1.2.4 隨訪 隨訪起始時間為放療開始時，截止時間為2017年5月。記錄患者總生存時間（放療結(jié)束至死亡或隨訪截止的時間）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法分析單因素與生存率之間的關(guān)系，并繪制生存曲線。同時采用Log-rank法檢測各生存曲線的差異。多因素分析采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征與生存率的關(guān)系 46例患者的中位生存時間為（24±6）個月，3年生存率為45.65%?；颊叩呐R床特征與生存率的關(guān)系見表1。

表1 患者的臨床特征與生存率的關(guān)系

由表1可見，患者的年齡、組織學分化程度以及淋巴結(jié)分期與生存時間均有關(guān)（均P＜0.05），當年齡≤65歲，分化程度越高，淋巴結(jié)分期越晚，患者的生存時間越長。而性別、吸煙、體重變化、病理類型均與生存時間無關(guān)（均P＞0.05）。

2.2 患者的臨床特征與T淋巴細胞浸潤程度的關(guān)系見表2。

表2 患者的臨床特征與T淋巴細胞浸潤程度的關(guān)系

由表2可見，腫瘤組織中CD4＋及CD8＋T淋巴細胞浸潤程度與患者年齡、性別、病理類型、組織學分化程度及淋巴結(jié)分期等臨床病理因素均無關(guān)（均P＞0.05）。

表3 CD4表達與生存率的關(guān)系

由表3～4可見，腫瘤組織及間質(zhì)組織高表達CD4者、間質(zhì)組織高表達CD8者3年總生存率均明顯高于低表達者（均P＜0.05）。圖1生存曲線顯示，對于接受術(shù)后放療的NSCLC患者，腫瘤組織中高表達CD4者生存期最長。腫瘤及間質(zhì)組織CD4和CD8的免疫組化染色圖片見圖2（插頁）。

表4 CD8表達與生存率的關(guān)系

圖1 腫瘤及間質(zhì)組織中不同CD4/CD8表達的NSCLC患者的生存曲線

2.4 患者3年總生存率與臨床特征的多因素分析 見表5。

表5 患者3年總生存率與臨床特征的多因素分析

由表5可見，腫瘤組織CD4高表達者的HR為0.048（95%CI：0.008～0.263，P＜0.01），而 CD8 高表達和CD4/CD8比值高表達的HR分別為1.800和1.500（均P＞0.05）。腫瘤組織高表達CD4是NSCLC患者3年總生存率的獨立預測因子。

3 討論

NSCLC占所有肺癌患者80%以上，30～40%的患者就診時已為局部晚期，單一的治療手段難以提高療效。早期患者通過手術(shù)切除可以獲得長期生存，而局部中晚期的患者即使達到了手術(shù)完全切除，預后仍然不佳[7-8]。因此，局部晚期NSCLC的綜合治療一直是臨床研究的熱點。

對于可切除的局部晚期NSCLC，局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍是其主要失敗原因，手術(shù)切除和術(shù)后輔助性化療是常用的治療方法。對于術(shù)后放療的價值，多個國內(nèi)外研究均證實放療使局部晚期NSCLC完整切除術(shù)后患者的局部控制率和生存率獲益[9-10]。Wang等[11]進行的一項大樣本量回顧性研究中，共入組3 395例行不完全切除術(shù)的肺癌患者，分為術(shù)后放療組和未行術(shù)后放療組，前者1 207例，后者2 188例。結(jié)果顯示，術(shù)后行輔助性放療者中位生存期、5年總生存率分別為33.5個月、32.4%，好于未接受放療者分別為23.7個月、23.7%，差異均有統(tǒng)計學意義，且術(shù)后放療者的死亡風險比未放療者下降了20%。該研究證實術(shù)后輔助性放療能提高Ⅱ～Ⅲ期N0～2手術(shù)不完全切除肺癌患者的總生存率。

本研究顯示，術(shù)后放療患者高表達CD4＋T淋巴細胞的中位生存期為32個月，3年生存率近40%。高表達CD4＋T淋巴細胞的肺癌患者，其3年生存率更高，反之則更低。對于手術(shù)切除未行放療的NSCLC患者，Jackute等[12]發(fā)現(xiàn)腫瘤組織浸潤CD4＋、CD8＋T淋巴細胞與總生存和無進展生存均無關(guān)聯(lián)，而腫瘤間質(zhì)組織高浸潤Foxp3＋CD4＋T淋巴細胞是改善NSCLC患者預后的獨立指標。Kinoshita等[13]也發(fā)現(xiàn)非腺肺癌中CD8＋T淋巴細胞低表達，腺癌吸煙患者中高Foxp3/CD4比值對于可切除的NSCLC患者是不良預后因素。因此，腫瘤組織高表達CD4＋T淋巴細胞對于可切除且行輔助放療的NSCLC患者來說，具有預測放療療效的價值，對于篩選出局部晚期NSCLC患者是否需行術(shù)后輔助放療具有重要意義。通過分層分析，發(fā)現(xiàn)不同淋巴細胞亞群表達的肺癌患者臨床特征基本一致，基本排除表達CD4＋/CD8＋T淋巴細胞的患者因其他臨床病理因素對于預后的影響。此外，有研究也表明同時高表達CD4和CD8對生存率的影響具有協(xié)同效應[14]，在本實驗中未觀察到相同效應。由此可見，腫瘤組織中CD4＋T淋巴細胞表達可以作為術(shù)后NSCLC患者輔助治療選擇的免疫標志物，更好地指導個體化治療。

腫瘤組織中CD4＋和CD8＋T淋巴細胞在肺癌患者的免疫反應中發(fā)揮著重要作用。CD4＋T淋巴細胞是免疫應答的主要反應細胞，其協(xié)調(diào)B淋巴細胞分化產(chǎn)生抗體。CD8＋T淋巴細胞則抑制抗體的合成、分泌及T淋巴細胞增殖。放療可能通過促進腫瘤相關(guān)抗原的表達，促進腫瘤基質(zhì)的免疫介導作用，減弱調(diào)節(jié)性T細胞的活性等來影響機體的免疫功能[3]。國內(nèi)學者實驗證實，CD4＋T淋巴細胞百分含量超出正常參考范圍的晚期乳腺癌患者，放療后CEA和CA15-3水平下降，與放療前比較，差異具有統(tǒng)計學意義[15]。Gupta等[16]也發(fā)現(xiàn)間質(zhì)低表達CD4/CD8預示細胞水平不足，從而無法實現(xiàn)放療放大效應。通過免疫治療促進免疫反應可能因此放大腫瘤基質(zhì)中缺乏CD4/CD8患者的放療反應。本研究也發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)組織CD8＋T淋巴細胞高表達在輔助放療的肺癌患者中具有高度的預測意義，同時提示間質(zhì)局部的免疫調(diào)節(jié)可能與放療之間存在某種關(guān)聯(lián)。

本研究通過對腫瘤組織及間質(zhì)組織中淋巴細胞的表達進行分選，初步證實肺癌腫瘤組織中CD4＋T淋巴細胞高表達可作為術(shù)后NSCLC患者輔助治療選擇的免疫標志物，更好地指導個體化治療。但是本結(jié)果仍然具有局限性，由于本研究樣本量較小，而且屬回顧性研究，存在患者選擇的偏倚。下一步筆者將繼續(xù)擴大樣本量，探討CD4高表達的機制，同時開展前瞻性研究，通過加強對體內(nèi)免疫細胞功能和生物標志物的認識，進一步探討術(shù)后接受輔助放療的NSCLC患者免疫細胞標志物的表達及其預后作用。

[1]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CACancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2]Holmberg L,Sandin F,Bray F,et al.National comparisons of lung cancer survivalin England,Norway and Sweden 2001-2004:differences occur early in follow-up[J].Thorax,2010,65(5):436-441.

[3]Van den HeuvelMM,Burgers SA,van Zandwijk N.Immunotherapy in nonsmall-cell lung carcinoma:from inflammation to vaccination[J].Clin Lung Cancer,2009,10(2):99-105.

[4]Demaria S,BhardwajN,McBride WH,et al.Combining radiotherapy and immunotherapy:a revived partnership[J].Int J Radiat OncolBiolPhys,2005,63(3):655-666.

[5]Reits EA,Hodge JW,Herberts CA,et al.Radiation modulates the peptide repertoire,enhances MHC class I expression,and induces successful antitumor immunotherapy[J].J Exp Med,2006,203(5):1259-1271.

[6]Hald SM,Bremnes RM,Al-Shibli K,et al.CD4/CD8 co-expression shows independent prognostic impact in resected non-small cell lung cancer patients treated with adjuvant radiotherapy[J].Lung cancer,2013,80:209-215.

[7]翟浩然,鐘文昭.ASCO 2015局晚期肺癌治療進展[J].浙江醫(yī)學,2015,18:1490-1492.

[8]邢力剛.2015年肺癌放療研究進展回顧[J].浙江醫(yī)學,2016,38(4):231-232,251.

[9]Mantovani C,Levra NG,Filippi AR,et al．Postoperative radiotherapy for patients with completely resected pathologic N2 non-small-cell lung cancer:a retrospective analysis[J].Clin Lung Cancer,2013,14(2):194-199．

[10]劉翼,阿迪力,陸艷榮,等.ⅢA(N2)期非小細胞肺癌術(shù)后放療療效分析[J].中國癌癥雜志,2013,6:452-456.

[11]Wang EH,Corso CD,Rutter CE,et al.Postoperative radiation therapy is associated with improved overall survival in incompletely resected stage II and III non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2015,33(25):2727-2734．

[12]Jackute J,Zemaitis M,Pranys D,et al.The prognostic influence of tumor infiltrating Foxp3+CD4+,CD4+and CD8+Tcells in resected non-small cell lung cancer[J].Journal of Inflammation,2015,12(1):63.

[13]Kinoshita T,Muramatsu R,Fujita T,et al.Prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes differs depending on histological type and smoking habit in completely resected non-small cell lung cancer[J].Annals of Oncology,2016,27:2117-2123.

[14]Hiraoka K,Miyamoto M,Cho Y,et al.Concurrent infiltration by CD8+T cells and CD4+T cells is a favourable prognostic factor in non-small-cell lung carcinoma[J].Br J Cancer,2006,94:275-280.

[15]朱江,何津祥,何津春.CD4+T細胞與放療前后腫瘤標志物變化[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2016,37(20):2828-2830.

[16]Gupta A,Probst HC,Vuong V,et al.Radiotherapy promotes tumor-specific effector CD8+T cells via dendritic cell activation[J].J Immunol,2012,189:558-566.