盛安群 錢燕 李昌崇 張雪雅 翁翠葉 張維溪

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一，目前世界各國哮喘發(fā)病率呈明顯上升趨勢。第三次中國城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查亦顯示，我國兒童哮喘患病率由1990年的1.09%上升到2010年的3.02%，其中過敏是哮喘發(fā)病的重要原因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)輔助性T細(xì)胞（Th）1、Th2在過敏性哮喘發(fā)病中起著重要作用，而近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用[2]。已有研究表明Notch信號(hào)通路在T細(xì)胞的分化和活化中發(fā)揮重要作用[3]。因此，本研究通過檢測過敏性哮喘患兒外周血中Th17細(xì)胞比例和Notch1、Notch4、維甲酸相關(guān)孤兒核受體（RORγt）mRNA表達(dá)情況，分析它們之間的相關(guān)性，明確Th17在過敏性哮喘發(fā)病中的作用及與Notch信號(hào)通路的關(guān)系，以進(jìn)一步闡明過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2016年1月至2017年2月就診于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院?？崎T診及住院過敏性哮喘患兒40例（哮喘組），男18例，女22例；中位年齡7歲。兒童哮喘診斷均按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。選擇同期在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢兒童40例作為健康對(duì)照組，男17例，女23例；中位年齡7.5歲；無過敏性疾病或其他慢性病史，1周內(nèi)無急性感染，無長期用藥史。入選兒童均檢測血總免疫球蛋白E（IgE）。兩組兒童性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；哮喘組嗜酸性粒細(xì)胞和血總IgE均明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患兒家屬知情同意。

表1 兩組兒童基本資料比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 人淋巴細(xì)胞分離液購自荷蘭Cedarlane公司，人溶血素購自北京索萊寶科技有限公司，佛波酯、莫能霉素、離子霉素均購自美國Sigma公司，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗人IL-17A抗體、IL-17的固定破膜劑均購自美國BD公司，人IL-17 ELISA試劑盒購自美國eBscience公司，引物序列由上?；瞪镉邢薰竞铣?。

1.2.2 外周血Th17細(xì)胞比例檢測 Th17細(xì)胞以不同熒光標(biāo)記的CD4抗體及IL-17A抗體標(biāo)記后，通過流式細(xì)胞儀器檢測其在淋巴細(xì)胞中的比例。取250μl全血，用不含胎牛血清的RPMI164培養(yǎng)液1∶1等體積稀釋到500μl，在稀釋好的全血中加入50ng/ml的刺激劑佛波酯/離子霉素和 1μg/ml的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷非德菌素A/莫能霉素，在37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后，實(shí)驗(yàn)管加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD4抗體，對(duì)照管加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，避光孵育30min，加入500μl固定破膜劑，充分混勻，避光孵育30min。重懸細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)管加入PE標(biāo)記的IL-17A抗體，對(duì)照管加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，避光孵育30min，上機(jī)檢測。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測相對(duì)表達(dá)量。Ficoll密度分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，參照Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照上游引物、下游引物、SYBR Green、Water nuclease-free反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR檢測，目的基因及內(nèi)參的引物序列如下：GAPDH引物序列：上游引物 5′-TGGGTGGCAGTGATGGCA-3′，下游引物 5′-GGAGAAGGCTGGGGCTCAT-3′；Notch1引物序列：上游引物 5′-GCAGAACAACAGGGAGGAGA-3′，下游引物 5′-CGGTTGGCAAAGTGGTCC-3′；Notch4引物序列：上游引物5′-CTGCCCCGTGCTTCAAT-3′，下游引物5′-CAGGTTGCCCTATTCCTACAG-3′；RORγt引物序列：上游引物 5′-CAATGGAAGTGGTGCTGGTTAG-3′，下游引物 5′-TTAGGGAGTGGGAGAAGTCAAAG-3′。

1.2.4 血清IL-17水平檢測 取哮喘組和健康對(duì)照組兒童外周血清1.5ml，采用ELISA法檢測血清中IL-17水平，具體操作按試劑盒提供的說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。兩正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，兩非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童外周血Th17細(xì)胞比例比較 哮喘組Th17細(xì)胞比例為（1.50±0.30）%，顯著高于健康對(duì)照組的（0.93±0.24）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 兩組兒童Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達(dá)水平比較 哮喘組Notch1、RORγt mRNA表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組（均P＜0.01），而兩組兒童Notch4 mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組兒童Notch1、Notch4、RORγt mRNA表達(dá)水平比較

2.3 兩組兒童IL-17水平比較 哮喘組IL-17水平為2.68（2.05，3.19）pg/L，顯著高于健康對(duì)照組的 2.20（1.89，2.72）pg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Notch1 mRNA與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 哮喘組Notch1 mRNA表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平、IL-17水平均呈正相關(guān)（r=0.780、0.555和0.636，均P＜0.01）。

3 討論

Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17A、IL-17F和IL-22等細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和過敏性疾病中發(fā)揮著重要作用，RORγt是其特異性的轉(zhuǎn)錄因子[5]。Peters等[6]研究發(fā)現(xiàn)致敏小鼠誘發(fā)的Th17細(xì)胞反應(yīng)跟氣道重塑相關(guān)。同時(shí)Newcomb等[7]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液中Th17分泌因子表達(dá)明顯增多，并且通過招募中性粒細(xì)胞、促進(jìn)黏液細(xì)胞分化、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生參與哮喘發(fā)病。本研究亦發(fā)現(xiàn)哮喘組患兒Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平、IL-17水平均顯著高于健康對(duì)照組，提示Th17細(xì)胞在過敏性哮喘患兒中發(fā)揮重要作用。

生命的過程是由遺傳信息系統(tǒng)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)共同調(diào)控的。從信號(hào)通路入手，能更好地闡明調(diào)控哮喘的發(fā)病機(jī)制，將為哮喘的診治提供新思路。Notch受體廣泛存在于多種生物體內(nèi)，Notch信號(hào)通路參與多種組織細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別、增殖、分化和凋亡等功能，在細(xì)胞命運(yùn)的決定中起重要作用[8-9]。本研究通過qRT-PCR法檢測哮喘組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch受體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)哮喘組患兒Notch1 mRNA表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，但兩組Notch4 mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示外周血中Notch1受體參與過敏性哮喘發(fā)病，Notch4受體未參與過敏性哮喘發(fā)病。

近年研究表明Notch信號(hào)通路在T細(xì)胞的分化和活化中發(fā)揮著重要作用，與哮喘發(fā)病關(guān)系密切[10]。Amsen等[11]發(fā)現(xiàn)抗原刺激機(jī)體抗原提呈細(xì)胞（APC）表面Notch配體的不同表達(dá)，促進(jìn)了不同淋巴細(xì)胞亞群的分化，Delta信號(hào)誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，而Jagged信號(hào)則誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化。Keerthivasan等[12]誘導(dǎo)Notch1基因沉默后的老鼠和人的原始CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化發(fā)現(xiàn)，原始CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的能力明顯減弱。Jiao等[13]亦發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中，用DAPT（一種γ-促分泌酶抑制劑）作用于脾單個(gè)核細(xì)胞阻斷Notch信號(hào)通路，可減少脾單個(gè)核細(xì)胞在Ⅱ型膠原蛋白刺激下產(chǎn)生Th1、Th17細(xì)胞的能力。本研究顯示過敏性哮喘患兒Notch1 mRNA表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)，說明Notch1與過敏性哮喘患兒Th17細(xì)胞具有密切的關(guān)系，Notch1可能通過促進(jìn)過敏性哮喘患兒Th17細(xì)胞的表達(dá)參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。T淋巴細(xì)胞亞群的分化依賴于相應(yīng)的特定轉(zhuǎn)錄因子和不同細(xì)胞因子的作用。RORγt是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)Notch1基因沉默后的原始CD4+T淋巴細(xì)胞在Th17誘導(dǎo)環(huán)境下，其RORγt mRNA表達(dá)水平明顯降低[14]。IL-17可以促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞、支氣管成纖維細(xì)胞等分泌IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子參與氣道炎癥反應(yīng)，同時(shí)這些炎癥因子可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，從而形成正反饋，進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[15-16]。本研究亦發(fā)現(xiàn)Notch1 mRNA表達(dá)與RORγt mRNA表達(dá)水平和IL-17水平均呈正相關(guān)，提示Notch信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和主要炎癥因子IL-17表達(dá)影響Th17的分化，從而參與過敏性哮喘的病理過程。

綜上所述，Th17細(xì)胞在過敏性哮喘患兒體內(nèi)發(fā)揮重要作用，Notch1受體通過影響Th17細(xì)胞表達(dá)參與過敏性哮喘患兒的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步深入開展Th17及Notch信號(hào)通路在過敏性哮喘患兒的作用研究，將成為哮喘治療潛在的新靶點(diǎn)。

[1]全國兒科哮喘協(xié)作組，中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所.第三次中國城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查[J].中華兒科雜志,2013,51(10):729-735.doi:10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2013.10.003.

[2]Hoe E,AndersonJ,NathanielszJ,etal.The contrasting roles ofT-h17 immunityinhumanhealthand disease[J].MicrobiolImmunol,2017,61(2):49-56.doi:10.1111/1348-0421.12471.

[3]Radtke F,Macdonald HR,Tacchini-Cottier F.Regulation of innate and adaptive immunity by Notch[J].Nat Rev Immunol,2013,13(6):427-437.doi:10.1038/nri3445.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組,編輯委員會(huì)中華兒科雜志.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)[J].中華兒科雜志,2016,54(3):167-181.doi:10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2016.03.003.

[5]Patel DD,Kuchroo VK.Th17 Cell Pathway in Human Immunity:Lessons from genetics and therapeutic interventions[J].Immunity,2015,43(6):1040-1051.doi:10.1016/j.immuni.2015.12.003.

[6]Peters M,Kohler-Bachmann S,Lenz-Habijan T,et al.Influence of an allergen-specific Th17 response on remodeling of the airways[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2016,54(3):350-358.doi:10.1165/rcmb.2014-0429OC.

[7]Newcomb DC,Jr Peebles RS.Th17-mediated inflammation in asthma[J].Curr Opin Immunol,2013,25(6):755-760.doi:10.1016/j.coi.2013.08.002.

[8]Ray LB.Tugging on Notch receptor tunes signaling[J].Science,2017,355(6331):1277-1279.doi:10.1126/science.355.6331.1277-s.

[9]陳微,曹毅,楊曉紅.紫草素對(duì)HaCaT細(xì)胞Notch-1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用[J].浙江醫(yī)學(xué),2017,39(3):156-159.

[10]Koyanagi A,Sekine C,Yagita H.Expression of Notch receptors and ligands on immature and mature T cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,418(4):799-805.doi:10.1016/j.bbrc.2012.01.106.

[11]Amsen D,Blander JM,Lee GR,et al.Instruction of distinct CD4 Thelper cellfates by different notch ligands on antigen-presenting cells[J].Cell,2004,117(4):515-526.

[12]Keerthivasan S,Suleiman R,Lawlor R,et al.Notch signaling regulates mouse and human Th17 differentiation[J].J Immunol,2011,187(2):692-701.doi:10.4049/jimmunol.1003658.

[13]Jiao Z,Wang W,Xu H,et al.Engagement of activated Notch signalling in collagen II-specific T helper type 1(Th1)-and Th17-type expansion involving Notch3 and Delta-like1[J].Clin Exp Immunol,2011,164(1):66-71.doi:10.1111/j.1365-2249.2010.04310.x.

[14]Binger KJ,Corte-RealBF,Kleinewietfeld M.Immunometabolic regulation of interleukin-17-Producing T helper cells:uncoupling new targets for autoimmunity[J].Front Immunol,2017,8:311.doi:10.3389/fimmu.2017.00311.

[15]Kuwabara T,Ishikawa F,Kondo M,et al.The Role of IL-17 and Related cytokines in inflammatory autoimmune diseases[J].Mediators Inflamm,2017,2017:3908061.doi:10.1155/2017/3908061.

[16]Kim BS,Park YJ,Chung Y.Targeting IL-17 in autoimmunity and inflammation[J].Arch Pharm Res,2016,39(11):1537-1547.doi:10.1007/s12272-016-0823-8.