周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

骨關(guān)節(jié)炎是年齡相關(guān)性疾病，目前認(rèn)為該病的病理核心是關(guān)節(jié)軟骨退變。筆者前一階段的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，取自《千金方》中的獨(dú)活寄生湯和《醫(yī)林改錯(cuò)》中的身痛逐瘀湯中的諸藥加以化裁而成的“骨痹活血湯”能明顯改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀，并且對(duì)其體內(nèi)炎癥因子NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）等均具有明顯下調(diào)作用[1]。川牛膝是該方劑中的主要藥材，牛膝多糖（ABPS）則是中藥牛膝的有效成分，它是一種免疫調(diào)節(jié)劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)ABPS具有抗腫瘤、抗衰老、細(xì)胞毒和多種免疫調(diào)節(jié)作用。但在之前的臨床實(shí)驗(yàn)中ABPS的治療作用是否是通過(guò)調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，維持關(guān)節(jié)軟骨正常的生物力學(xué)功能，尚未進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞體系，利用ABPS對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡以及凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行研究，以期為其臨床應(yīng)用提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 6周齡新西蘭大白兔1只，體重0.6kg，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。DMEM完全培養(yǎng)基、FBS（美國(guó)GibcoBRL公司），甲苯胺藍(lán)、ABPS、白蘆藜醇、尼克酰胺、硝普鈉、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TAKARA公司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2X）（立陶宛 MBI Fermentas公司），Trizol抽提試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。RT-PCR引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代軟骨細(xì)胞提取及培養(yǎng) 將新西蘭白兔于耳緣靜脈注射空氣處死。無(wú)菌操作下沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開關(guān)節(jié)囊，暴露關(guān)節(jié)面，用手術(shù)刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS緩沖液沖洗數(shù)次后，移入超凈臺(tái)，將軟骨組織剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒搖蕩消化30min，輕輕吹打棄去上清液，用PBS緩沖液清洗3次；再加入2g/L的Ⅱ型膠原酶5ml并移入消化瓶中，將消化瓶放置恒溫?fù)u箱中，消化3～4h。待大部分細(xì)胞游離時(shí)，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，用15ml離心管收集細(xì)胞，低溫離心1 000r/min，10min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸液均勻分布。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的觀察與鑒定 取軟骨細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化特點(diǎn)，并進(jìn)行攝片記錄。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺藍(lán)染色30min，顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞。

1.2.3 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞置于5%CO2混和氣體環(huán)境中，37℃恒溫箱內(nèi)單層培養(yǎng)，隔3d首次換液，傳代培養(yǎng)期間，每隔2～3d根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換1次完全培養(yǎng)基。待鏡下觀察細(xì)胞增殖匯集成片，并鋪滿培養(yǎng)瓶底。占底面積70%～80%可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，按1∶3比例接種至75cm2培養(yǎng)瓶中，并標(biāo)記為P1代細(xì)胞。按上述方法，培養(yǎng)至P3代軟骨細(xì)胞。

1.2.4 分組 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代軟骨細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物，分為：（1）無(wú)凋亡誘導(dǎo)組（10%FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（2）硝普鈉組（1.0mmol/L硝普鈉＋10%FBS DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（3）白蘆藜醇組（1.0mmol/L硝普鈉＋100μmol/L白蘆藜醇＋10%FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（4）尼克酰胺組（1.0mmol/L硝普鈉＋20mmol/L尼克酰胺＋10%FBS DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（5）ABPS 200μg/ml組（1.0mmol/L 硝普鈉＋200μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（6）ABPS 300μg/ml組（1.0mmol/L硝普鈉＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）；（7）ABPS 400μg/ml組（1.0mmol/L 硝普鈉＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）。

1.2.5 軟骨細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 根據(jù)1.2.4處理與分組細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用不含EDTA的胰酶消化、收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集（1～5）×105細(xì)胞。加入100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng) 10min。加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 NAMPT、Sirt1、p53和 Bax mRNA 表達(dá)水平測(cè)定用Trizol法提取P3代軟骨細(xì)胞RNA，行RT-PCR法獲得cDNA，冰上混合脫氧核糖核酸嵌合熒光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl，上下游引物各 0.4μl、雙蒸水5.2μl及cDNA 4μl，輕輕混勻，離心5s后進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為50°C預(yù)變性 2min，95°C變性10min，95°C 退火 30s，60°C 延伸 30s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線判斷反應(yīng)的特異性并通過(guò)2-ΔΔCt得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞鏡下觀察 制備的兔原代軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)狀態(tài)下大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形，72h基本全部貼壁生長(zhǎng)，見圖1。

2.2 ABPS對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與無(wú)凋亡誘導(dǎo)組比較，硝普鈉組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與硝普鈉組比較，白蘆藜醇組、ABPS各組軟骨細(xì)胞凋亡率均明顯下降（均P＜0.05），而尼克酰胺組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＞0.05）。與ABPS 200μg/ml組比較，ABPS 300μg/ml組及 ABPS 400μg/ml組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯下降（均P＜0.05），見圖2-3。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鏡下觀察（×200）

圖2 細(xì)胞凋亡流式分析圖

2.3 各組軟骨細(xì)胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表達(dá)水平比較 與無(wú)凋亡誘導(dǎo)組比較，硝普鈉組凋亡相關(guān)基因p53和Bax mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與硝普鈉組比較，白蘆藜醇組NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，p53和Bax mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；尼克酰胺組NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，BAX mRNA的表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。不同濃度ABPS組中，ABPS 300μg/ml組效果最明顯，NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，p53和Bax mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，與硝普鈉組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表 2。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,其主要病變是骨關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變和繼發(fā)骨質(zhì)增生，是多種生物因素與機(jī)械損傷因素相互作用而引起的生物力學(xué)紊亂所致的病理改變[2-3]。最容易累及負(fù)重和關(guān)節(jié)活動(dòng)度大的膝關(guān)節(jié)，其次為髖關(guān)節(jié)、脊柱、手指關(guān)節(jié)等部位。它所帶來(lái)的疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙等癥狀嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。因此，如何有效地調(diào)控軟骨細(xì)胞的功能，維持關(guān)節(jié)軟骨正常生物學(xué)功能日益成為科研的重點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)，P1代至P3代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究退行性骨關(guān)節(jié)病最適宜的靶細(xì)胞[4]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用P3代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立凋亡模型。

在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖一樣，都離不開信號(hào)的傳導(dǎo)，即細(xì)胞增殖或死亡的刺激信號(hào)通過(guò)細(xì)胞外、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核，最后產(chǎn)生應(yīng)答的途徑傳導(dǎo)。近年來(lái)的研究一致認(rèn)為p38信號(hào)通路是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的一條重要上游信號(hào)通路之一[5]。p38通過(guò)兩條途徑使p53蛋白表達(dá)增加而引起軟骨細(xì)胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一個(gè)上游激酶），從而使NF-κB活化，進(jìn)而增加p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；二是直接磷酸化p53的絲氨酸15殘基，穩(wěn)定p53蛋白，使其含量增加。p53則通過(guò)誘導(dǎo)促凋亡因子Bax的表達(dá)而引起細(xì)胞凋亡[6]。與促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳動(dòng)物的同源基因，是一種依賴NAD+的組蛋白去乙?；?，能與多種轉(zhuǎn)錄因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，與細(xì)胞衰老、凋亡、代謝和增殖分化密切相關(guān)。Takayama等[7]研究證實(shí)Sirt1與人體軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)SRT1720能夠激活Sirt1，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。NAMPT廣泛表達(dá)于人體內(nèi)臟脂肪組織、肌肉、骨骼、肝臟等器官和組織，并表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞，可見該蛋白在生理及病理狀態(tài)下均有重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1活性控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和眾多代謝過(guò)程，具有抗凋亡作用[10]。硝普鈉可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[11]，本實(shí)驗(yàn)中硝普鈉凋亡誘導(dǎo)組的p53、Bax基因的表達(dá)明顯高于其他組，說(shuō)明在凋亡過(guò)程中存在p53-Bax信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活。

圖3 ABPS對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響（與無(wú)凋亡誘導(dǎo)組比較，*P＜0.05；與硝普鈉組比較，△P＜0.05；與 ABPS 200μg/ml組比較，▲P＜0.05）

表2 各組軟骨細(xì)胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表達(dá)水平比較（n＝6）

本實(shí)驗(yàn)利用了白蘆藜醇和尼克酰胺2種試劑，白蘆藜醇是Sirt1的激動(dòng)劑[12]，尼克酰胺是Sirt1的抑制劑[13]。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白蘆藜醇能使NAMPT和Sirt1 mRNA表達(dá)上調(diào)，經(jīng)p53-Bax途徑抑制硝普鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡；尼克酰胺則下調(diào)NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)，并經(jīng)p53-Bax途徑加強(qiáng)硝普鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)，白蘆藜醇組細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硝普鈉組，尼克酰胺組則高于硝普鈉凋亡誘導(dǎo)組，證明白蘆藜醇通過(guò)對(duì)Sirt1的調(diào)控抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，而尼克酰胺能促使軟骨細(xì)胞凋亡，這與文獻(xiàn)報(bào)道也是一致的[14]。

本實(shí)驗(yàn)在體外用ABPS干預(yù)硝普鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)ABPS有類似于白蘆藜醇的作用，能夠上調(diào)抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表達(dá)及下調(diào)凋亡基因p53和Bax mRNA的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)同樣證實(shí)ABPS處理后，兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率均有所降低，且凋亡率隨其濃度的增加而減小，表明ABPS對(duì)凋亡誘導(dǎo)條件下軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，且在濃度為300μg/ml時(shí)即可以出現(xiàn)明顯效果。由此筆者得出初步結(jié)論，ABPS通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mR－NA的表達(dá)及下調(diào)凋亡基因p53和Bax mRNA的表達(dá)，經(jīng)p53-Bax途徑來(lái)抑制硝普鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。這是ABPS保護(hù)軟骨細(xì)胞、預(yù)防骨關(guān)炎的機(jī)制之一，也為ABPS的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是本研究也存在不足之處，例如ABPS具體通過(guò)影響哪種凋亡機(jī)制來(lái)保護(hù)軟骨細(xì)胞，還通過(guò)哪些信號(hào)傳導(dǎo)通路影響了凋亡機(jī)制等。鐘甫華等[15]利用實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)前交叉韌帶離斷術(shù)4周制動(dòng)飼養(yǎng)后，大白兔關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了降解破壞的形態(tài)特征，利用這種方法亦可以驗(yàn)證ABPS是否在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有意義。以上幾個(gè)方面都將是后續(xù)研究重點(diǎn)關(guān)注的方向。

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