王靜 徐小敏 蘭香 周燕

宮頸癌是除乳腺癌之外的最常見的女性惡性腫瘤。研究表明宮頸癌高發(fā)年齡為45～60歲，宮頸癌具有發(fā)現(xiàn)晚、預(yù)后差、病死率高等特點，已嚴重威脅絕經(jīng)后婦女的身心健康[1-2]。目前液基細胞學技術(shù)（thinprep cytologic test，TCT）和高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）DNA檢測作為宮頸癌篩查的兩大手段已廣泛應(yīng)用于臨床，且有效降低了宮頸癌的發(fā)病率。我國已步入老齡化社會，聯(lián)合篩查在這一群體中也廣泛應(yīng)用。但由于絕經(jīng)后婦女雌激素水平低，宮頸萎縮，宮頸細胞發(fā)生異型性改變，導(dǎo)致TCT存在一定的假陰性；而HPV DNA檢測只能反映病毒感染的類型，不能反映病毒致病的活性。HPV E6/E7 mRNA是HPV病毒持續(xù)感染并整合到人體基因組后，致癌活性激活產(chǎn)生的mRNA，代表著癌基因的活動，其檢測可以用于評估宮頸癌的發(fā)病風險和預(yù)后[3-4]。本研究通過對1 032例絕經(jīng)后婦女的宮頸篩查結(jié)果進行分析，以病理診斷為金標準，將HPV E6/E7 mRNA與TCT及HR-HPV DNA進行比較，評價其診斷絕經(jīng)后婦女宮頸病變的價值，為實現(xiàn)絕經(jīng)后宮頸病變婦女早診早治提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年2月至2017年2月在本院行TCT和HR-HPV DNA聯(lián)合篩查的絕經(jīng)后婦女1 032例，年齡 45～70（54.4±6.7）歲，絕經(jīng)年限 1～25（8.5±6.3）年。排除標準：（1）既往有TCT異常史、HPV感染史及宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）史者；（2）有宮頸手術(shù)史者；（3）3d內(nèi)有陰道沖洗及用藥者。

1.2 檢查方法

1.2.1 TCT、HR-HPV DNA檢測 去除宮頸表面黏液和分泌物，采用一次性宮頸刷深入宮頸管，同一方向旋轉(zhuǎn)5～10周，將已經(jīng)刷取下脫落細胞的宮頸刷放入裝有細胞保存液的瓶中進行漂洗。TCT檢測結(jié)果按2001年伯塞斯達系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）分為正常范圍（NILM）、不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）、非典型鱗狀上皮細胞不除外高度病變（ASC-H）、鱗狀上皮內(nèi)低度病變（LSIL）、鱗狀上皮內(nèi)高度病變（HSIL）、鱗狀上皮細胞癌（SQCC）、不能明確意義的非典型腺細胞（AGUS）和腺癌（AC）。所有TCT涂片均由2位細胞學醫(yī)師獨立閱片和診斷。本研究以TCT結(jié)果≥ASC-US為細胞學陽性，＜ASC-US為細胞學陰性。HRHPV DNA檢測的耗材和試劑來自美國Hologic公司，用于檢測的細胞來自TCT檢測后剩余的細胞保存液。按基因親緣關(guān)系遠近將HR-HPV分為A5/A6組、A7組和A9組。A5/A6組檢測 HPV51、56和 66型，A7組檢測HPV18、39、45、59 和 68 型，A9 組檢測 HPV16、31、33、35、52和58型。TCT細胞學陽性者或（和）HR-HPV DNA陽性者均行HPV E6/E7 mRNA檢測、陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 檢測試劑盒及儀器均為河南新鄉(xiāng)科蒂亞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。（1）取樣：樣本采集方法同TCT、HR-HPV DNA檢測。（2）檢測方法：經(jīng)標本裂解、配置檢測緩沖液、布板、信號放大、讀板5個關(guān)鍵的步驟定量檢測HPV E6/E7 mRNA。（3）結(jié)果判讀：將所讀數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入數(shù)據(jù)處理軟件進行電腦計算，最后

檢測結(jié)果為拷貝數(shù)。本研究以HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)≥1copy/ml為陽性。

1.2.3 陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷 拭去宮頸分泌物后分別行醋酸白及碘試驗，對醋酸白及碘試驗陰性者常規(guī)取3、6、9、12點組織活檢，而醋酸白異常及碘試驗陽性者在異常區(qū)域多點活檢。病理診斷標準參照2014年WHO修訂的婦女生殖器官腫瘤分類系統(tǒng)[5]。所有標本均由2位病理醫(yī)師獨立閱片和診斷。本研究以病理結(jié)果≥HSIL為病理陽性，＜HSIL為病理陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示；非正態(tài)分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用 Kruskal-Wallis H 檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；兩組變量的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果關(guān)系 1 032例絕經(jīng)后婦女中，TCT細胞學陽性者154例，陽性率14.9%；HR-HPV陽性者210例，陽性率20.3%。其中TCT陽性或（和）HR-HPV DNA陽性者289例，均行HPV E6/E7 mRNA檢測、陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷。HPV E6/E7 mRNA陽性者158例，陽性率54.7%。病理診斷陽性者51例，其中HSIL 44例，宮頸癌7例；病理陰性者238例，其中宮頸炎182例，LSIL 56例。病理診斷與 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果關(guān)系見表1。

表1 病理診斷與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果關(guān)系（例）

2.2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA 對病理分級HSIL以上（HSIL＋）診斷價值的比較 TCT診斷HSIL＋的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均低于 HPV E6/E7 mRNA，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2＝31.335、4.862、15.736 和 20.357，均P＜0.05）。HR-HPV DNA診斷HSIL＋的靈敏度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值與HPV E6/E7 mRNA比較，差異均無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.793、1.387和 0.004，均 P ＞0.05）；而特異度明顯低于HPV E6/E7 mRNA，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝20.794，P＜0.01）。3種檢測方法中HPV E6/E7 mRNA的特異度最高，見表2。

表2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA對HSIL＋診斷價值的比較

2.3 不同病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達量的關(guān)聯(lián)性 以宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸癌作為4個不同的病理等級，比較不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA的表達量有無差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義（H＝15.644，P＜0.01）。Spearman秩相關(guān)分析顯示，病理分級與HPV E6/E7 mRNA 表達量呈正相關(guān)（r＝0.401，P＜0.01），見表 4。

表3 不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA表達量分布

3 討論

宮頸癌是女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。目前研究已經(jīng)證實宮頸癌的明確病因是HR-HPV的持續(xù)感染。HR-HPV的復(fù)制與宮頸上皮細胞的分化直接相關(guān)，癌基因E6、E7在表面和中間層分化晚期的細胞中表達。HPV感染細胞的過程中，病毒基因組會整合到人基因組，其中癌基因E6、E7與細胞基因產(chǎn)物結(jié)合并對它們進行調(diào)控，改變細胞生長周期和DNA修復(fù)，造成基因組不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致細胞永生化。因此病毒癌基因E6、E7的連續(xù)表達是宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化的必要條件。由此認為HPV E6/E7 mRNA檢測可以識別婦女HPV持續(xù)性感染及宮頸病變的風險[6-9]。HPV E6/E7 mRNA檢測作為重要的臨床輔助診斷技術(shù)，近年來已被歐洲生殖器感染和腫瘤研究機構(gòu)作為重點研究對象[10]。

HPV E6/E7 mRNA檢測可檢測包括16、18等在內(nèi)的14種HR-HPV的mRNA，不僅可以降低LSIL的陰道鏡活檢率，而且對HSIL的診斷及術(shù)后隨訪也有較高的價值[4]。Duvlis等[11]研究結(jié)果表明，在診斷HSIL時HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV DNA檢測。而Ho等[12]也認為，在診斷HSIL時HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度較好。Pierry等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不管年齡＞30歲還是＜30歲，HPV E6/E7 mRNA檢測診斷HSIL的靈敏度均較高。Ho等[12]、Pierry等[13]及Benevolo等[14]均認為對細胞學為ASC-US及LSIL者，HPV E6/E7 mRNA比HPV DNA更適合作為分流的手段。Benevolo等[14]還指出，對于HPV陽性者，HPV E6/E7 mRNA作為分流的手段優(yōu)于細胞學。以上研究表明，HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸疾病的診斷中應(yīng)用廣泛，然而其在絕經(jīng)后婦女這一特殊群體中宮頸疾病篩查的診斷價值目前少見報道。

國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）統(tǒng)計顯示，70歲以上的宮頸癌患者占全部宮頸癌患者的12.0%[15]。中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院一項研究也表明，≥65歲的宮頸癌患者占同期所有宮頸癌患者的10.8%，且中晚期患者比例高達89.3%[15]。深究原因可能為絕經(jīng)后婦女由于健康意識差、思想保守等原因，較少參加婦科普查，不易發(fā)現(xiàn)早期宮頸病變；且絕經(jīng)后婦女性生活減少，宮頸癌的早期癥狀如性生活出血不容易出現(xiàn)。TCT及HR-HPV DNA檢測技術(shù)作為目前先進的宮頸癌篩查技術(shù)，在宮頸癌的防治工作中發(fā)揮著非常重要的作用。但是絕經(jīng)后婦女即使進行TCT及HR-HPV DNA檢測，假陽性率及假陰性率較非絕經(jīng)期婦女明顯增高，且重復(fù)性差，從而導(dǎo)致部分婦女延誤或過度治療。主要有以下3方面原因：（1）絕經(jīng)后婦女雌激素水平降低,下生殖道萎縮，宮頸鱗狀上皮層變薄，宮頸鱗-柱交界區(qū)常常上移，鱗-柱交界處細胞取樣困難，臨床往往難以取到滿意的細胞量，這直接影響了TCT制片質(zhì)量及 HPV DNA提取；（2）絕經(jīng)后婦女的TCT往往提示萎縮性細胞學改變，這與高度上皮內(nèi)病變、不成熟化生等的鑒別有一定的困難；（3）在宮頸癌篩查工作中，篩查人員的專業(yè)水平、經(jīng)驗、診斷水平及對診斷標準的把握等均影響篩查效果[16]。本研究中TCT的靈敏度（0.29）、特異度（0.42）均較低，而 HR-HPV 靈敏度（0.90）較高，但特異度（0.31）較低，這與上述結(jié)論一致。

絕經(jīng)后婦女的 HPV病毒負荷量較高。研究發(fā)現(xiàn)HPV感染在人群中呈U型或S型分布，第1個高峰在25～35歲，第2個高峰在＞55歲年齡段[17]，且感染HRHPV婦女的年齡越大，越容易發(fā)生嚴重的宮頸病變[18]。本研究中7例宮頸癌患者中有6例年齡在55歲以上，全部感染HR-HPV，與以上研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)3種檢測方法中TCT的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均較低，故筆者不推薦在絕經(jīng)后婦女中單獨使用TCT作為宮頸癌的篩查手段。HPV E6/E7 mRNA在3種檢測方法中特異度最高，與TCT及HR-HPV DNA比較差異均有統(tǒng)計學意義，可見在絕經(jīng)后婦女中HPV E6/E7 mRNA檢測較TCT及HR-HPV DNA更精準，能更為準確地篩選出高危人群。但HPV E6/E7 mRNA靈敏度為0.84，漏診率為15.7%，因此，筆者也不建議其單獨應(yīng)用于絕經(jīng)后婦女宮頸癌的篩查。近年來，多項研究表明在普通人群中HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合細胞學檢測可提高宮頸癌早期篩查的準確性[19-21]；而作為細胞學異常的分流手段，HPV E6/E7 mRNA特異度明顯高于HR-HPV DNA[21]。結(jié)合本研究，筆者認為在絕經(jīng)后婦女中也可將HPV E6/E7 mRNA與細胞學聯(lián)合檢測或?qū)⑵渥鳛榧毎麑W或HR-HPV DNA檢測異常患者的分流手段。

本研究還發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女HPV E6/E7 mRNA表達量越高，嚴重病變可能性越大，這與Ratnam等[22]及王璐等[23]的研究一致。這說明對于高表達量的患者要引起警惕。然而具體表達量的高低是否有明確的數(shù)據(jù)截點，有待于以后大樣本的研究明確。

綜上所述，絕經(jīng)后婦女宮頸病變有其特殊性，應(yīng)尋找適合其特點的篩查方案。HPV E6/E7 mRNA檢測對絕經(jīng)后婦女HSIL+病變的篩查具有較高特異度，可與TCT聯(lián)合可用于宮頸癌初篩，也對宮頸癌常規(guī)篩查細胞學異?；騂R-HPV陽性具有分流意義，有助于減輕絕經(jīng)后婦女的心理負擔，避免臨床上的過度治療。且HPV E6/E7 mRNA表達量隨著宮頸病變嚴重級別的升高而增加，對預(yù)測絕經(jīng)后婦女高級別CIN及宮頸癌的風險有重要的臨床價值。

[1]郎景和.子宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷與治療[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2011,36(5):261-263.doi:10.3760/j.issn:0529-567X.2001.05.001.

[2]賀昕紅,藺莉.絕經(jīng)后婦女宮頸細胞學檢查異常的臨床分析[J].中國全科醫(yī)學,2009,12(8):1390-1391.doi:10.3969/j.issn.1007-9572.2009.15.011.

[3]Poljak M,Kocjan BJ,Ostrbenk A,et al.Commercially available molecular tests for human papillomaviruse s(HPV):2015 update[J].J Clin Virol,2016,76(Suppl 1):S3-S13.doi:10.1016/j.jcv.2015.10.023.

[4]Origoni M,Cristoforoni P,Carminati G,et al.E6/E7 mRNA testing for human papillomavirus induced high-grade cervical intraepithelial disease(CIN2/CIN3):a promising perspective[J].Cancer Med Sci,2015,9:533-535.doi:10.3332/ecancer.2015.533.

[5]Kurman RJ,Cracangiu ML,Simon HC,et al.World Health Organization classification of tumours of female reproductive organs[M].Lyon:IARC Press,2014.

[6]Carter JR,Ding Z,Rose BR.HPVinfection and cervicaldisease:a review[J].Aust N Z J of Obstet Gyn,2011,51(2):103-108.doi:10.1111/j.1479-828X.2010.01269.x.

[7]馮松濤,張志剛.人乳頭瘤病毒致癌機制的研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志,2010,30(1):81-85.

[8]劉桐宇,謝榕.人乳頭瘤病毒E6、E7基因致癌機制及臨床應(yīng)用進展[J].中華生物醫(yī)學工程雜志,2013,19(2):172-175.doi:10.3760/cma.j.issn.1674-1927.2013.02.020.

[9]Cattani P,Siddu A,D'Onghia S,et al.RNA(E6 and E7)assays versus DNA(E6 and E7)assays for risk evaluation for women infected with human papillomavi rus[J].J Clin Microbiol,2009,47(7):2136-2141.doi:10.1128/JCM.01733-08.

[10]Cuschieri K,Wentzensen N.Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkerss for the improved diagnosis of cervical neoplasia[J].Cancer Epidemiology Biomarkers＆Prevention,2008,17(10):2536.doi:10.1158/1055-9965.EPI-08-0306.

[11]Duvlis S,Popovska-Jankovic K,Arsova ZS,et al.HPV E6/E7 mRNA versus HPVDNA biomarker in cervical cancer screening of a group of Macedonian women[J].J Med Virol,2015,87(9):1578-1586.doi:10.1002/jmv.24199.

[12]Ho CM,Pan KY,Chen YY,et al.Clinical performance of multiplex high-risk E6 mRNA expression in comparison with HPV DNA subtypes for the identification of women at risk of cervical cancer[J].J Med Virol,2015,87(8):1404-1412.doi:10.1002/jmv.24194.

[13]Pierry D,Weiss G,Lack B,et al.Intracellular human papillomavirus E6,E7 mRNA quantification predicts CIN 2+in cervical biopsies better than Papanicolaou screening for women regardless of age[J].Arch Pathol Laborat Med,2012,136(8):956-960.doi:10.5858/arpa.2011-0180-OA.

[14]Benevolo M,Vocaturo A,Caraceni D,et al.Sensitivity,specificity,and clinical value of human papillomavirus(HPV)E6/E7 mRNAassay as a triage test for cervical cytology and HPV DNA test[J].J Clin Microbiol,2011,49(7):2643-2650.doi:10.1128/JCM.02570-10.

[15]程敏,吳令英,章文華,等.215例老年宮頸癌的臨床分析[J].中華腫瘤雜志,2009,31(5):388-391.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2009.05.015.

[16]章文華.宮頸癌篩查方法與我國宮頸癌篩查面臨的新問題[J].中華腫瘤雜志,2008,30(12):881-884.doi:10.3321/j.issn:0253-3766.2008.12.001.

[17]Synen K,Kulmala SM,Shabalova I,et al.Epidemiological,clinical and viral determinants of the increased prevalence of high-risk human papillomavirus(HPV)infections in elderly women[J].Eur J GynaecolOncol,2008,29(2):114-122.

[18]鄒冰玉,浦海鷹,李丹,等.210例高危型人乳頭瘤病毒感染檢測及宮頸病變影響因素的探討[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2013,29(12):938-940.

[19]張博,張穎,牛力春,等.液基細胞學聯(lián)合HPVmRNA檢測對宮頸癌的診斷價值[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2016,24(1):118-122.doi:10.3969/j.issn.1672-4992.2016.01.034.

[20]黃寶英,周倫順,富顯果,等.HPVE6/E7 mRNA檢測對宮頸癌篩查意義的初步評價[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(14):1061-1064.doi:10.16073/j.cnki.cjcpt.2013.14.004.

[21]潘瓊慧,黃凌霄,朱雪燕,等.HR-HPVE6/E7mRNA在宮頸細胞學ASCUS分流診斷中的意義[J].浙江醫(yī)學,2016,38(13):1089-1092.

[22]Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al.Clinical performance of the Pre Tect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2779-2785.doi:10.1128/JCM.00382-10.

[23]王璐,王晨陽,王武亮,等.高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測對宮頸高度鱗狀上皮內(nèi)病變診斷及隨訪價值研究[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2016,32(6):580-582.