樊啟文，陳伶俐，趙麗，石敏，晏向華*1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢430070；2.生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.生豬精準飼養(yǎng)與飼料安全技術湖北省工程實驗室，武漢430070）

內(nèi)質網(wǎng)是細胞內(nèi)分泌蛋白和跨膜蛋白折疊和成熟的主要場所，它對蛋白質的加工過程依賴其內(nèi)腔中的多種蛋白酶[1]。當流入內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)腔中的未折疊或錯誤折疊蛋白超過其自身處理能力而出現(xiàn)大量積累時，會導致內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生。未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）是細胞內(nèi)應對內(nèi)質網(wǎng)應激的關鍵性細胞信號通路，主要通過減少內(nèi)質網(wǎng)腔中蛋白質的流入及增強內(nèi)質網(wǎng)的處理能力，從而維持內(nèi)質網(wǎng)功能的穩(wěn)定[1]。當內(nèi)質網(wǎng)功能障礙不能通過調(diào)節(jié)恢復時，UPR也能夠啟動細胞凋亡程序以保證機體免受未折疊或錯誤折疊蛋白的侵害[2-3]。

UPR能夠介導位于內(nèi)質網(wǎng)膜上的3種內(nèi)質網(wǎng)應激感受器的激活，包括：活化轉錄因子6（activating transcription factor-6,ATF6），雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like ER kinase,PERK）和肌醇依賴性內(nèi)質網(wǎng)至細胞核信號激酶1（inositol-requiring ER-to-nucleus signal kinase-1,IRE1）[4-6]。作為一種Ⅱ型跨膜蛋白，ATF6能夠被蛋白水解酶激活形成一種可溶性的轉錄因子，并轉位至細胞核中發(fā)揮作用[7]。PERK蛋白能夠感受內(nèi)質網(wǎng)腔中的折疊壓力，并促進ATF4蛋白的表達[8]。X盒結合蛋白1（X box binding protein 1,XBP1）是一種轉錄因子，能夠被ATF6和IRE1激活，其中ATF6能夠促進XBP1基因的表達，而IRE1則參與XBP1 mRNA的剪切，從而表達出具有活性的轉錄因子[9]。ATF4、ATF6和XBP1都是堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper,bZIP）轉錄因子，能夠直接與內(nèi)質網(wǎng)應激效應元件（ER stress response element,ERSE）結合，激活UPR靶基因的轉錄[7,9]。

研究發(fā)現(xiàn)，激素和細胞因子的釋放、能量狀態(tài)的改變等都能夠改變內(nèi)質網(wǎng)中蛋白質的通量，從而導致內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生[10]。仔豬早期斷奶是在豬生產(chǎn)過程中最常見的誘導應激發(fā)生的事件之一。仔豬在早期斷奶過程中，食物狀態(tài)的快速轉變會引發(fā)仔豬嚴重的饑餓應激。研究表明，早期斷奶能夠使仔豬腸道消化吸收及黏膜屏障功能受損，同時降低腸道消化酶的活性，引起腸道消化吸收功能的減弱和仔豬營養(yǎng)缺乏[11-12]，而由營養(yǎng)饑餓引發(fā)的蛋白質代謝的改變可能直接影響到內(nèi)質網(wǎng)的結構與功能。

多項研究顯示，在斷奶仔豬日糧中補充特定的氨基酸能夠減緩由斷奶刺激引發(fā)的器官損傷[13-15]。其中，在日糧中添加精氨酸能夠促進腸黏膜微血管的發(fā)育[16]，促進β-防御素基因和血管內(nèi)皮生長因子的表達[13,17]。而作為一種重要的支鏈氨基酸，亮氨酸能參與蛋白質生物合成、胰島素信號傳導、骨骼肌的能量調(diào)節(jié)等過程。此外，在肝中亮氨酸對糖脂代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]，并且肝作為機體內(nèi)蛋白質代謝最旺盛的器官，亮氨酸也能影響其蛋白質的合成，從而影響肝中內(nèi)質網(wǎng)的功能[19-20]。因此，本試驗通過給斷奶仔豬飼喂不同含量的亮氨酸日糧以研究亮氨酸對早期斷奶引起的肝內(nèi)質網(wǎng)應激的影響，為仔豬的早期營養(yǎng)調(diào)控提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

動物試驗選用的斷奶仔豬為華中農(nóng)業(yè)大學國家家畜工程技術中心精品豬場健康仔豬，品種為長×大二元仔豬；所有動物試驗的操作均經(jīng)過華中農(nóng)業(yè)大學動物中心倫理委員會批準。

細胞試驗中使用的人肝癌細胞系（human hepatocarcinoma cell,HepG2）由華中農(nóng)業(yè)大學生命科學學院楊在清老師饋贈；細胞試驗所用基礎培養(yǎng)基（DMEM）、無葡萄糖培養(yǎng)基（glucose-free DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、Earle平衡鹽緩沖液（Earle’s balanced salt solution,EBSS）和青霉素-鏈霉素（penicillin-streptomycin）均購于美國Gibco公司；低葡萄糖基礎培養(yǎng)基（low glucose DMEM）和氨基酸缺失培養(yǎng)基（amino acid-free RPMI-1640）購于美國Sigma公司；免疫印跡試驗中的XBP1、ATF4、ATF6、HDAC1和β-actin抗體均購于美國Santa Cruz公司，所用二抗購于美國Sigma公司；核質分離試驗所用試劑盒購于美國Thermo Fisher科技公司。

1.2 動物試驗設計

試驗Ⅰ：選取18頭體質量接近的閹割仔豬，隨機平均分為2組，每組9頭，分別為對照組和斷奶組。對照組仔豬為哺乳仔豬；斷奶組仔豬在14日齡進行斷奶，并補充仔豬教槽料，同時試驗期間保持自由采食和飲水。于仔豬15日齡和16日齡時，分別從2組中隨機各選取3頭進行屠宰取樣。

試驗Ⅱ：選取48頭體質量接近的14日齡閹割仔豬，隨機平均分為2組，每組3個重復，每個重復8頭，分別為對照組和高亮氨酸組。仔豬由14日齡開始進行誘飼，對照組仔豬飼喂基礎日糧，日糧亮氨酸含量為1.66%；高亮氨酸組在基礎日糧中額外添加0.44%的亮氨酸。日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。在21日齡時從2組中各選取3頭仔豬進行屠宰取樣，剩余仔豬進行斷奶處理；斷奶后，在22日齡時再從2組中各選取3頭仔豬進行屠宰取樣。

2次試驗均采集仔豬肝組織樣品，其中部分樣品剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊后于2.5%戊二醛中固定；其余樣品剪成小塊以錫箔紙包裹，于液氮中速凍后放入-80℃冰箱中保存。

1.3 細胞試驗處理

1.3.1 營養(yǎng)缺失處理試驗

試驗前，將HepG2細胞培養(yǎng)于正常完全培養(yǎng)基中，待細胞生長至密度為80%時，將完全培養(yǎng)基分別更換為以下培養(yǎng)基：正常新鮮完全培養(yǎng)基（CK）、含0.75μg/mL衣霉素（內(nèi)質網(wǎng)應激的誘導劑，作為陽性對照）的完全培養(yǎng)基（tunicamycin,TUN）、完全饑餓培養(yǎng)基（EBSS）、低糖培養(yǎng)基（low glucose,LG）、無糖培養(yǎng)基（no glucose,-G）、無亮氨酸培養(yǎng)基（no leucine,-LEU）和無氨基酸培養(yǎng)基（no amino acid,-AA），處理1 h后收集細胞樣品。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平Table1 Composition and nutrient level of basal diets

1.3.2 亮氨酸缺失與再補加試驗

亮氨酸缺失處理與營養(yǎng)缺失處理相同，但亮氨酸缺失處理時間分別設置為0、0.5、1、2和4 h，處理完成后統(tǒng)一收集細胞樣品。

亮氨酸的再補加試驗是在亮氨酸缺失1 h后，向培養(yǎng)基中補加亮氨酸，使培養(yǎng)基中亮氨酸的終濃度分別為1和10 mmol/L。CK為對照組，在TUN組中加入0.75μg/mL衣霉素。

1.4 試驗方法

1.4.1 仔豬肝組織的電鏡檢測

采集肝樣品時，保持采集位置的一致性，將所采集的樣品用2.5%戊二醛固定2 h后，使用1%鋨酸固定液再固定2～3 h；之后通過梯度脫水程序，在37℃條件下，使用Epon包埋2～3 h，并制作超薄切片；最后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后在透射電鏡下進行觀察。

1.4.2 肝組織和細胞樣品的核質分離

肝組織和HepG2細胞的核質分離試驗均使用美國Thermo Fisher科技公司的核質分離試劑盒完成，相關分離操作依照試劑盒說明書進行。取肝組織研磨成粉末和細胞沉淀，使用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次洗滌后均于4℃、1 000 r/min下離心5 min。將收集到的沉淀重懸于預冷的細胞質提取試劑CERⅠ溶液（使用前加入1μg/mL亮抑酶肽，1μg/mL胃蛋白酶抑制劑，1μg/mL抑肽酶和50μg/mL苯甲基磺酰氟）中，并按比例加入CERⅡ溶液。經(jīng)過4℃、1.6萬r/min離心5 min后，收集到的上清液即為細胞質蛋白組分。隨后，沉淀用細胞核提取試劑NER溶液（使用前加入蛋白酶抑制劑）重懸，冰上裂解10 min后渦旋5 s。將裂解和渦旋操作重復4次后，經(jīng)過4℃、1.6萬r/min離心10 min，所得上清液即為細胞核蛋白組分。

1.4.3 蛋白質樣品的免疫印跡檢測分析

將肝組織和HepG2細胞中提取的蛋白質樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）進行分離。然后將蛋白質電轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride,PVDF）膜上，并將電轉后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉[溶于含0.1%Tween 20的三乙醇胺緩沖鹽溶液（tris-buffered saline with Tween 20,TBST）]中室溫封閉1 h。之后，將PVDF膜置入用TBST稀釋適當濃度的一抗中4℃過夜孵育。第2天，經(jīng)TBST洗滌后，將PVDF膜置入用TBST稀釋適當濃度的二抗中室溫孵育1 h。顯影后的結果使用Image J軟件進行定量分析。

1.5 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均進行至少3次獨立重復試驗。采用Graphpad prism 5軟件的學生t檢驗對數(shù)據(jù)進行處理，并采用雙尾t檢驗進行分析。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 仔豬的早期斷奶應激誘發(fā)肝內(nèi)質網(wǎng)應激

內(nèi)質網(wǎng)的形態(tài)結構與其功能高度相關。電鏡圖像（圖1A）顯示：在正常條件下，仔豬肝組織細胞內(nèi)粗面內(nèi)質網(wǎng)口徑狹窄，平滑折疊的環(huán)繞于線粒體；而在斷奶后24 h，內(nèi)質網(wǎng)口徑出現(xiàn)顯著擴張，且內(nèi)質網(wǎng)明顯增多；隨著斷奶時間的延長，在斷奶后48 h，內(nèi)質網(wǎng)大量增生并且折疊結構混亂。為進一步分析早期斷奶是否影響肝內(nèi)質網(wǎng)應激反應，我們對內(nèi)質網(wǎng)應激的標志性蛋白XBP1[21]在細胞核中的含量進行了檢測。結果（圖1B）顯示：斷奶后24 h，仔豬肝組織中細胞核內(nèi)XBP1蛋白含量顯著上調(diào)；而斷奶后48 h，細胞核內(nèi)XBP1的表達水平未見顯著變化。這些結果表明，早期斷奶能夠誘導仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生，但這種誘導作用存在一定的時限。

2.2 不同營養(yǎng)缺失處理對Hep G2細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的影響

由于仔豬的消化系統(tǒng)發(fā)育不完全，營養(yǎng)饑餓往往是早期斷奶過程的主要刺激因素之一[22-23]。同時，營養(yǎng)不足也被認為是內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生的一個誘導因素，其中葡萄糖缺失已被證實能夠誘導內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生，并且多個葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose regulated protein,GRP）是參與UPR反應的關鍵蛋白，如GRP78[24]。體外肝細胞（HepG2）試驗的結果（圖2）表明：低葡萄糖和葡萄糖缺失處理均能顯著上調(diào)細胞核內(nèi)的ATF4和ATF6α的表達（P＜0.05）；同時，EBSS處理和亮氨酸的缺失也能夠誘導細胞核內(nèi)的ATF6α顯著上調(diào)表達（P＜0.05）；此外，1 h氨基酸饑餓處理未能顯著改變內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白的表達水平，這一結果與亮氨酸的缺失對ATF6α的上調(diào)表達相反，暗示單一亮氨酸的缺失對HepG2中內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生更具有誘導效應。然而，在所有處理條件下的XBP1均呈現(xiàn)差異表達，這提示我們XBP1表達在內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生過程中具有滯后性。上述結果表明，營養(yǎng)物質缺失能夠誘導肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生，而亮氨酸的缺失能夠誘導HepG2中內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生。

圖1 早期斷奶對仔豬肝組織內(nèi)質網(wǎng)形態(tài)及XBP1蛋白表達的影響Fig.1 Effects of early weaning on morphology of endoplasmic reticulum(ER)and expression of XBP1 protein in the liver of piglets

圖2 在不同營養(yǎng)物質缺失處理下Hep G2細胞內(nèi)ATF6α、ATF4和XBP1在細胞質和細胞核內(nèi)的豐度變化Fig.2 Abundance changes of ATF6α,ATF4 and XBP1 in the cytoplasm and nucleus of HepG2 cells under different nutrient deficiency levels

2.3 亮氨酸對Hep G2細胞中內(nèi)質網(wǎng)應激的調(diào)節(jié)

為了探究亮氨酸對內(nèi)質網(wǎng)應激的影響，將HepG2細胞培養(yǎng)于亮氨酸缺失的培養(yǎng)基中，結果如圖3所示。與對照組相比，亮氨酸缺失0.5、1和2 h均能夠顯著上調(diào)細胞質中ATF6α的表達（P＜0.05），而細胞核內(nèi)的ATF4和ATF6α在亮氨酸缺失1 h處理條件下均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達（P＜0.05）。同時，亮氨酸的再補加試驗顯示，添加1和10 mmol/L亮氨酸均能顯著上調(diào)細胞核內(nèi)ATF4的表達（P＜0.05）。上述結果表明，亮氨酸缺失能夠誘導HepG2細胞中內(nèi)質網(wǎng)應激，而1和10 mmol/L亮氨酸的加入加重了內(nèi)質網(wǎng)的應激狀態(tài)。

2.4 不同亮氨酸水平對早期斷奶應激誘發(fā)的仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激的影響

如圖4所示：在未斷奶條件下，飼用高水平亮氨酸日糧并不影響仔豬肝中ATF4和ATF6α的表達；斷奶處理24 h后，仔豬肝組織細胞核內(nèi)ATF4和ATF6α均呈顯著性上調(diào)表達（P＜0.05）。這一結果表明亮氨酸能夠增強早期斷奶誘發(fā)的仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激。

圖3 亮氨酸缺失及再補加對Hep G2細胞中ATF6α和ATF4蛋白表達的影響Fig.3 Effectsof leucinedeprivation and restimulation on expression of ATF6αand ATF4 proteinsin HepG2 cells

圖4 不同亮氨酸水平對斷奶仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of different leucine（Leu）levels on expression of ERstress-associated proteins in the liver of weaning piglets

3 討論

仔豬的早期斷奶應激是仔豬經(jīng)受的最嚴重的應激事件之一，在早期斷奶過程中仔豬的采食量及生長速率都呈現(xiàn)顯著下調(diào)[22]。為了應對斷奶過程中產(chǎn)生的各種刺激，仔豬往往通過調(diào)整其自身體內(nèi)的能量供給狀態(tài)以度過這一應激過程，這種調(diào)整通常包括增加血液供給、加強能量生成、改變免疫以及炎癥反應等[25]。這樣的過程也伴隨著蛋白質合成速率的改變，進而影響了內(nèi)質網(wǎng)的功能。當來自細胞內(nèi)或細胞外的刺激誘導內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生時，細胞通過UPR反應減弱刺激從而維持細胞代謝的穩(wěn)態(tài)[26]。本研究顯示，仔豬在斷奶24 h后，其肝組織內(nèi)肝細胞中的內(nèi)質網(wǎng)口徑顯著增加且形態(tài)出現(xiàn)紊亂，并且核內(nèi)的XBP1表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)，表明早期斷奶能夠誘導肝組織內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生。

仔豬在早期斷奶過程的所有刺激中，營養(yǎng)水平是其中非常重要的一個因素。研究顯示，早期斷奶能夠損害仔豬的腸道黏膜功能，影響營養(yǎng)物質的消化吸收[23]。而營養(yǎng)物質的缺失也同樣是內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生的誘導因素之一[26]。在體外肝細胞中的模擬試驗表明，葡萄糖以及亮氨酸的缺失能夠顯著上調(diào)細胞核內(nèi)ATF4和剪切后ATF6α的表達。這一結果顯示，葡萄糖、氨基酸（尤其是亮氨酸）等營養(yǎng)的饑餓處理能夠誘導肝細胞中內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生。

有報道指出，葡萄糖的缺失能夠通過氨基己糖通路誘導內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生，從而激活UPR通路及CHOP介導的細胞凋亡通路[27]。在小鼠肝中，亮氨酸能夠抑制過度發(fā)生的內(nèi)質網(wǎng)應激及自噬[28]。此外，精氨酸的缺失能夠促進ATF4的翻譯，增強UPR反應[29]。在本研究中，亮氨酸缺失能夠顯著上調(diào)肝細胞核內(nèi)ATF4和ATF6α剪切體蛋白的表達，表明亮氨酸可以獨立誘導肝細胞中內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生。然而，當在亮氨酸缺失培養(yǎng)基中補加1 mmol/L或者10 mmol/L亮氨酸時，細胞核內(nèi)ATF4的表達也呈現(xiàn)顯著性上調(diào)。此外，不同亮氨酸含量的日糧對于正常21日齡仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激無顯著影響；但是在仔豬斷奶24 h后，用高水平亮氨酸日糧飼喂的仔豬肝組織中肝細胞核內(nèi)定位的ATF4出現(xiàn)顯著上調(diào)。這與HepG2細胞試驗中亮氨酸過量再補加的結果相似，推測這一現(xiàn)象可能與氨基酸的代謝功能相關。

內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生后，內(nèi)質網(wǎng)激酶PERK的激活能夠增加eIF2α的磷酸化水平從而抑制蛋白質的合成[30-32]。然而，氨基酸作為一種營養(yǎng)信號，能夠直接刺激蛋白質的合成，亮氨酸的作用尤其明顯[33]。作為一種支鏈氨基酸，亮氨酸能夠通過與其感受體結合，強烈地刺激體內(nèi)雷帕霉素靶蛋白復合體1（mechanistictargetof rapamycincomplex1,mTORC1）信號通路的激活，進而促進蛋白質的合成[34-35]。同時，早期斷奶能夠誘導仔豬肝、脾和骨骼肌中自噬的發(fā)生[36]。自噬對幼年動物具有重要的維持生存作用，而亮氨酸是細胞自噬的抑制劑。研究證明，內(nèi)質網(wǎng)應激發(fā)生后能夠依賴于IRE1-JNK通路激活自噬，并利用其降解再循環(huán)的功能維持細胞的穩(wěn)態(tài)[37]。而KOUROKU等[38]發(fā)現(xiàn)，異常表達的多聚谷氨酰胺72能誘導細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生，并伴隨著細胞中PERK/eIF2α磷酸化介導的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變。有觀點認為，細胞自噬對蛋白質的降解作用有助于減緩內(nèi)質網(wǎng)的蛋白質處理壓力，幫助內(nèi)質網(wǎng)恢復穩(wěn)態(tài)。因此，亮氨酸的促蛋白質合成功能及其對自噬的抑制作用可能加劇了細胞內(nèi)的內(nèi)質網(wǎng)應激和UPR反應，使得核內(nèi)的ATF4呈現(xiàn)上調(diào)表達。此外，在動物生長的早期階段，氨基酸能夠參與調(diào)節(jié)多個重要的代謝過程，包括生長、穩(wěn)態(tài)、免疫、食物的攝取與利用及蛋白質的合成等[39-41]。而研究顯示，在日糧中添加1%、2%和4%亮氨酸并不能顯著提高早期斷奶仔豬的日增質量和采食量，在日糧中6%的亮氨酸添加量甚至會顯著抑制仔豬的生長[42]。這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是日糧中高水平的亮氨酸損害了機體的氨基酸的平衡[41]。然而B’CHIR等[43]報道指出，隨著亮氨酸水平的不斷上升，全細胞水平的ATF4表達量不斷下調(diào)。因此，亮氨酸對于仔豬肝內(nèi)質網(wǎng)應激具有重要的調(diào)節(jié)功能，但其調(diào)節(jié)機制仍有待闡明。

4 結論

本研究表明，早期斷奶能夠誘導仔豬肝中內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生，而亮氨酸對內(nèi)質網(wǎng)應激具有重要的調(diào)控功能，無論是亮氨酸的缺失還是過量都會引起肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生。因此，篩選出適宜的亮氨酸濃度對于減緩仔豬斷奶后的應激狀態(tài)具有十分重要的意義。

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