王天云，張青，朱良均，楊明英

（浙江大學動物科學學院應用生物資源研究所，杭州310058）

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）是人體骨組織中的主要無機成分，具有良好的生物相容性、骨誘導性和骨傳導性，在骨組織工程領域具有良好的應用前景。研究表明，HAp的形貌、顆粒大小、形狀等對其成骨性具有很大影響。天然骨組織中的羥基磷灰石是在體內鈣離子、磷酸根離子與天然膠原蛋白相互作用下形成的針狀納米顆粒[1]。如何利用有機分子和無機離子的相互作用制備出具有良好的促干細胞分化及成骨性的HAp形貌是骨組織工程領域的研究熱點之一[2]。

絲素蛋白（silk fibroin,SF）是一種性能優(yōu)良且容易獲取的天然高分子，其內部結構由一系列小的疏水性氨基酸及親水性大側鏈氨基酸組成。這種組分和結構賦予了絲素蛋白易于降解、結構可控和良好的生物相容性等特性[3]。隨著生物材料的發(fā)展，絲素蛋白已經在組織工程、腫瘤治療和檢測及納米醫(yī)學等領域得到了應用和實踐。絲素蛋白本身所具有的羧基能很好地結合鈣離子，進而調控HAp的形成及形貌。研究表明，絲素纖維和絲素蛋白膜在HAp礦化液中能很好地調控HAp的成核和生長，所得到的各種形貌的HAp能表現出不同的生物相容性和骨誘導活性，從而促進骨修復[3-4]。

目前，絲素纖維或絲素膜調控HAp的沉積形貌通常是在模擬體液中通過自然礦化的方式完成。該方法雖然工藝條件溫和，但制備周期過長，一般需要7 d的礦化才能實現HAp完全覆蓋材料表面[5]。電化學沉積HAp技術是一種利用電場從電解液中沉積粒子到導電基體上從而得到HAp涂層的方法。其簡要原理是：在通電的情況下，陰極表面由于水的電解，產生氫氣，導致局部pH隨電流強度的增大而升高；在較高pH下，電解液中的Ca2+和H2PO4-與溶液中的OH-反應，導致溶液局部過飽和，當飽和程度達到磷酸鈣鹽化合物溶解度時，在陰極上即可沉積出相對應條件的磷酸鈣鹽涂層[6]。由于其工藝溫和、非直線涂覆及可控性強等特點，因此，近年來在仿生礦化HAp涂層中廣受采用，并能獲得形貌各異的HAp涂層[7]。

本文擬結合絲素蛋白和電化學沉積對HAp形貌的調控能力，通過改變沉積過程中的工藝參數，以期制備出具有良好生物相容性和成骨性能的HAp形貌，為HAp和HAp/SF復合材料在骨修復中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

試驗儀器：1702型電子分析天平（Sartorius GMBHGottingen公司，德國）、CH8660型電磁爐（客浦公司）、MD44透析袋（8～4 kDa）、GZX-9140MBE型數顯電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、8400s型傅里葉紅外光譜儀（Shimadzu公司，日本）、SIRO型掃描電子顯微鏡（FEI公司，荷蘭）、IVIUM電化學系統(tǒng)（基本型，荷蘭）。

試驗材料：家蠶繭，由浙江大學動物科學學院應用生物資源研究所提供；無水Na2CO3、溴化鋰（LiBr）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；NaOH、Ca(NO3)2·4H2O、HNO3、(NH4)2HPO4、丙酮、乙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

圖1 基底表面電化學沉積HAp涂層原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of HAp coating on basement surface by electrochemical deposition

1.2 方法

1.2.1 再生絲素蛋白溶液的制備

蠶繭脫膠處理：將1 cm2大小的繭殼放入0.01 g/mL Na2CO3溶液中煮沸30 min，重復1次后，用清水洗凈并干燥得到脫膠的絲素纖維；然后將脫膠的絲素纖維按0.1 g/mL浸沒于9.3 mol/L的LiBr溶液中，60℃水浴3 h，使絲素纖維完全溶解；隨后經透析、濃縮得到合適濃度的再生絲素溶液，備用。

1.2.2 HAp在SF膜表面的電化學沉積

采用電化學暫態(tài)法模式和三電極體系，以SF/Ti片為陰極，鉑環(huán)為陽極，電解液體系為Ca(NO3)2和NH4H2PO4，在室溫下進行電化學沉積。該過程的原理如圖1所示。沉積涂層經去離子水沖洗后，自然晾干，用于后續(xù)檢測表征。

鈦（Ti）基體預處理[8]：采用4 cm×5 cm×1 mm的鈦板作為金屬基體，經砂紙磨光，去離子水清洗后，置于HF和HNO3混合溶液[V(HF)∶V(HNO3)=1∶3]中酸洗10 min，再置于丙酮和乙醇混合溶液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中超聲清洗15 min，用去離子水保存待用。

SF/Ti板復合電極的制備：在鈦板電極上滴加絲素蛋白溶液，自然條件下風干后，用75%乙醇處理使其β化；將貼合了絲素膜的鈦板作為陰極電極，采用電化學暫態(tài)法在SF/Ti板復合板上進行HAp的電化學沉積。

電解液的制備：配制0.042 mol/L Ca(NO3)2·4H2O和0.025 mol/L(NH4)2HPO4的混合溶液作為電解液，用0.1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值。

1.3 HAp的表征

HAp形貌觀察：利用SIRON型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）表征沉積的HAp形貌。首先在電鏡板上貼合導電膠，將制備好的樣品黏合于導電膠上，進行噴金處理后用于SEM觀察。

HAp元素組成表征：通過SEM的電子能譜分析（electron diffraction spectroscopy,EDS）檢測沉積HAp的元素組成。

HAp晶相分析：采用XPert Powder型X射線衍射儀（帕納科公司，荷蘭），對基底上所沉積的HAp粉末進行物相分析。測試條件為：管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率5（°）/min，衍射角范圍0～90 °。

HAp化學結構表征：采用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析沉積HAp的化學結構。將樣品與溴化鉀（KBr）以質量比1∶100混合，用研缽研磨成粉后置于50℃烘箱中烘干2 h，最后壓成薄片進行檢測。設定儀器掃描范圍為400～4 000 cm-1。

圖2 沉積前后SF/Ti板表面圖Fig.2 Images of SF/Ti plate surface before and after electrochemical deposition

2 結果與討論

2.1 沉積時間對HAp形貌的影響

從圖2中可以看出，在電化學沉積初期，表面有白色物質形成，而隨著時間的延長，涂層明顯加厚且更均勻。

圖3為沉積電流密度1.5 mA/cm2、電解液pH 4.7，電化學沉積時間分別為1、5、10、20、30、35、45和60 min時所得到的HAp涂層形貌。從中可知：在沉積時間為1 min時，涂層形貌初步形成，呈塊狀平臺，伴隨有小顆粒沉積（圖3A）；當沉積時間為5 min時，出現多孔平面，能觀察到脊狀結構以及小顆粒的球狀團簇晶體（圖3B）；10 min時的球狀團簇晶體變多，可以看到球表面有均勻突出的針尖（圖3C）；20 min時，觀察到的涂層結構為多孔平面上生長著球狀團簇晶體，其上的針尖開始交錯，整體形似花簇花枝（圖3D）；當沉積時間達到30 min時，可以看到平整多孔涂層，孔隙較為均一（圖3E）；當時間延長至35 min時，涂層表面在30 min形貌基礎上出現新生花簇形沉積，散落在多孔平臺表面（圖3F）；到45 min時，球狀團簇晶體在形貌頂端聚集，趨向于形成新的多孔平面（圖3G）；最后在60 min時，在電鏡圖中可以觀察到規(guī)則花簇狀沉積的突起（圖3H）。這表明在不同沉積時間下，HAp在SF/Ti板表面以多層累積的方式沉積。

從上述變化中可知，當沉積時間為1 min時沉積形貌初步形成，隨著時間延長至30 min時，絲素蛋白膜表面可以礦化出均勻平整的多孔結構，這種均一可控的形貌是后續(xù)促干細胞分化及成骨的理想形貌[9]。因此，1 min和30 min為研究電流密度和電解液pH對沉積形貌影響的最佳時間點。

2.2 電流密度和電解液p H值對HAp形貌的影響

為進一步探討電解液pH與電流密度對HAp形貌的影響，觀察了當沉積時間為1 min時，不同電流密度與電解液pH下涂層的電鏡形貌（圖4）。當沉積電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時，可以觀察到納米球狀涂層（圖4A）。當沉積電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時，涂層主要以塊狀沉積為主（圖4B），與常規(guī)的納米羥基磷灰石球狀沉積不同。當沉積電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時，所得的涂層呈現尚未完全的多孔平面形貌（圖4C）。當沉積電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時，所得涂層形成了花瓣堆疊形貌（圖4D）。

當沉積時間為30 min時，不同沉積電流密度與電解液pH下涂層的電鏡形貌如圖5所示。當電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時，涂層表面呈現為多孔結構，孔隙較為均一（圖5A）。當電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時，觀察到的涂層形貌為一多孔平面，孔隙較為均一，部分區(qū)域為平滑表面（圖5B）。當電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時，涂層平面已經生長完全，在電鏡圖上可以觀察到平面表面分布著大量無規(guī)則多孔（圖5C）。而電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時，可以觀察到均勻多孔平面，且孔隙為均一的納米孔（圖5D）。

圖4 沉積時間1 min時不同沉積電流密度及電解液p H下HAp的電鏡圖Fig.4 SEM imagesof HAp depostied for 1 min under different ampere densities and electrolyte pH

圖5 沉積時間30 min時不同沉積電流密度及電解液p H下HAp的電鏡圖Fig.5 SEM images of HAp deposited for 30 min under different amperedensitiesand electrolytepH

2.3 沉積HAp涂層成分、晶相及化學結構的表征

通過觀察不同沉積時間、電流密度和電解液pH下所沉積的HAp電鏡圖可以發(fā)現，當電解液pH為5.3、電流密度為2.5 mA/cm2、沉積時間為30 min時，可以得到具有理想結構的沉積涂層，此時的涂層孔隙均勻，表面平整。因此，本研究利用EDS能譜分析、X射線衍射（X-ray diffraction,XRD）分析及FTIR分析對該涂層的成分、晶相組成及化學結構進行了進一步表征。EDS能譜結果（表1）表明，在沉積的白色粉末中Ca/P約為1.8，與胡仁等[10]的結果（Ca/P為1.67）較為接近。

圖6A為沉積HAp的FTIR圖譜。從中可觀察到，在3 000～3 600 cm-1處H2O中OH-有伸縮振動峰，在1 640 cm-1處純HAp結合水有伸縮振動峰。研究證明，在1 400 cm-1處有碳酸根伸縮振動峰[11]，1 000～1 200 cm-1處有四面體非對稱伸縮振動峰，以及500～650 cm-1處有彎曲振動峰[12]。這些吸收振動峰的存在說明本研究得到的白色粉末確實為HAp。圖6B為絲素蛋白基底上利用電化學沉積所得白色沉積粉末的XRD圖譜。該圖譜顯示了 HAp 在（100）、（002）、（210）、（211）、（130）、（222）、（213）和（304）這些晶面的特征衍射峰，但總體上XRD衍射峰較寬。結合以往的研究[13-14]，說明這些沉積的白色粉末為結晶不完全的HAp。

表1 SF膜表面沉積HAp的元素含量Table1 Element of HAp deposited on SFfilm surface

圖6 SF膜表面沉積HAp的FTIR圖譜（A）和XRD圖譜（B）Fig.6 FTIR(A)and XRD(B)spectraof HAp deposited on SFfilm surface

3 結論

本研究以SF膜為基底，結合電化學方法于常溫下成功制備了納米HAp涂層，詳細探討了各試驗參數（電流密度、沉積時間和電解液pH）對沉積HAp形貌的影響。當電解液pH為5.3、電流密度為2.5 mA/cm2、沉積時間為30 min時，可以得到孔隙尺寸均一、整體形貌平整的沉積涂層，其結晶型也與天然骨組織中的納米HAp結晶型類似。本研究揭示了利用電化學方法在SF膜表面沉積HAp的規(guī)律，為制備不同結構和功能的HAp/SF復合材料提供了設計思路和理論參考。

參考文獻(References)：

[1] 王琳婷,楊明英,朱良均,等.絲膠蛋白/羥基磷灰石復合支架材料的制備及性能研究.蠶業(yè)科學,2010,36(4):639-644.

WANG L T,YANG M Y,ZHU L J,et al.Preparation and performance of silk sericin/hydroxyapatite composite bone scaffold.Science of Sericulture,2010,36(4):639-644.(in Chinesewith English abstract)

[2] 葉偉.鈦表面電化學沉積納米羥基磷灰石涂層研究.杭州:浙江大學,2007:18-23.

YE W.Titanium surface electrochemical deposition of nanometer hydroxyapatite coating.Hangzhou:Zhejiang University,2007:18-23.(in Chinese with English abstract)

[3] 帥亞俊,王捷,張青,等.絲蛋白在生物材料領域的最新研究進展.蠶業(yè)科學,2017,43(6):889-897.

SHUAIY J,WANG J,ZHANG Q,et al.Latest advances in silk-based biomaterials.Science of Sericulture,2017,43(6):889-897.(in Chinese with English abstract)

[4] 帥亞俊,何文,閔思佳,等.仿生生物礦化在絲素蛋白生物材料中的應用.蠶業(yè)科學,2012,38(6):1118-1124.

SHUAI Y J,HE W,MIN S J,et al.Application of biomineralization in silk fibroin biomaterials.Science of Sericulture,2012,38(6):1118-1124.(in Chinese with English abstract)

[5] 馮美林,張青,朱良均,等.利用等離子體技術調控絲素纖維表面性能誘導其仿生礦化的研究.蠶業(yè)科學,2017,43(1):124-131.

FENG M L,ZHANG Q,ZHU L J,et al.Surface property regulation and biomimetic mineralization of silk fibroin fibers by air-plasma technology.Science of Sericulture,2017,43(1):124-131.(in Chinese with English abstract)

[6] 馬春燕,羅傳旭,李立華,等.HOPG片電化學沉積羥基磷灰石初探.功能材料,2012,43(6):744-747.

MA C Y,LUO C X,LI L H,et al.Exploration of the electrochemical deposition of hydroxyapatite on HOPG.Journal of Functional Materials,2012,43(6):744-747.(in Chinese with English abstract)

[7] 王航.鈦表面功能化膜層的構建及電化學沉積鈣磷涂層的研究.廣州:廣東工業(yè)大學,2015:31-39.

WANG H.Study of functionalization membrane modified on titanium surface and interation with calcium phosphate nucleation by electrochemical deposition.Guangzhou:Guangdong University of Technology,2015:31-39.(in Chinese with English abstract)

[8] 劉茂林.鈦表面電化學法沉積摻鍶羥基磷灰石涂層及其形貌控制.杭州:浙江大學,2015:21-26.

LIU M L.Electrochemical deposition and morphology control of strontium-substituted hydroxyapatite coatings on titanium surface.Hangzhou:Zhejiang University,2015:21-26.(in Chinese with English abstract)

[9] 劉冰.鈦及鈦合金表面生物活性磷酸鹽轉化膜的制備與表征.濟南:山東大學,2017:60-93.

LIU B.Preparation and characterization of bioactive phosphate chemical conversion coatingson titanium and itsalloys.Jinan:Shandong University,2017:60-93.(in Chinese with English abstract)

[10]胡仁,時海燕,林理文,等.電化學沉積羥基磷灰石過程晶體生長行為.物理化學學報,2005,21(2):197-201.

HU R,SHI H Y,LIN L W,et al.The crystal growth behavior of hydroxyapatite coating on titanium substrate under electrochemical deposition conditions.Acta Physico-Chimica Sinica,2005,21(2):197-201.(in Chinese with English abstract)

[11]SHIRKHANZADEH M.Direct formation of nanophase hydroxyapatite on cathodically polarized electrodes.Journal of Materials Science:Materials in Medicine,1998,9(2):67-72.

[12]WANG X,ZHUANG J,PENG Q,et al.Liquid-solidsolution synthesis of biomedical hydroxyapatite nanorods.Advanced Materials,2006,18(15):2031-2034.

[13]ABDEL-AAL EA,DIETRICH D,STEINHAEUSERS,et al.Electrocrystallization of nanocrystallite calcium phosphate coatings on titanium substrate at different current densities.Surfaceand Coatings Technolog y,2008,202(24):5895-5900.

[14]ELIAZ N,SRIDHAR T M.Electrocrystallization of hydroxyapatite and its dependence on solution conditions.Crystal Growth&Design,2008,8(11):3965-3977.