王少華，趙盼盼，劉通，丁彪，羅磊，曹祖兵，張運(yùn)海，張坤*

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，哺乳動物分子胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥230036）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），又稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的重大傳染性豬病，是危害我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的第一大病毒性疫病，也是全球性疫病，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。PRRS病毒能感染不同品種和年齡的豬，但最易感染妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬。妊娠母豬感染PRRS病毒發(fā)病后會出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)、死亡和木乃伊胎；仔豬感染PRRS病毒發(fā)病后會出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉和呼吸窘迫。此外，藍(lán)耳病還會引起豬免疫抑制，造成豬免疫力低下，引起豬群的繼發(fā)感染[1]。

正因?yàn)樨i藍(lán)耳病對養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的巨大危害，國內(nèi)外許多科學(xué)家一直致力于研究豬藍(lán)耳病的致病和防控機(jī)制。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，豬CD163蛋白可能是PRRS病毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的主要受體[2]。2014年，美國密蘇里大學(xué)PRATHER課題組率先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了敲除豬CD163基因的基因編輯豬[3]，并在之后的攻毒實(shí)驗(yàn)中證明，敲除了CD163基因的基因編輯豬能夠正常存活并且抵抗PRRS病毒的感染，強(qiáng)有力地證明了CD163是PRRS病毒感染豬的必需受體[4]?？紤]到豬CD163蛋白還有其他正常的生物學(xué)功能，2017年，英國羅斯林研究所的科學(xué)家們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)精確地刪除了豬CD163蛋白與PRRS病毒直接結(jié)合的SRCR5（scavenger receptor cysteinerich domain 5）結(jié)構(gòu)域，獲得的基因編輯豬同樣能夠抵抗PRRS病毒的感染，同時，在基因編輯豬中表達(dá)的不含SRCR5結(jié)構(gòu)域的CD163蛋白還能夠正常發(fā)揮其生物學(xué)功能[5]。由此可見，對豬的CD163基因進(jìn)行編輯是生產(chǎn)可以抵抗藍(lán)耳病病毒感染的豬的一種可行性方法。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來被廣泛應(yīng)用的一種基因編輯技術(shù)，可以精確地對基因組進(jìn)行定點(diǎn)刪除、插入或置換等改造。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)極大地提高了對目的基因的編輯效率，使得基因編輯技術(shù)在大動物研究中得以廣泛的應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，我國科學(xué)家先后獲得了基因編輯豬[6-10]和羊[11]等。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由2個重要的元件構(gòu)成——識別特異DNA序列的單鏈的導(dǎo)向RNA（sgRNA）和切割DNA雙鏈的Cas9核酸內(nèi)切酶（Cas9 nuclease）。很多研究表明，與Cas9核酸內(nèi)切酶相比，使用突變了一個活性域的Cas9切刻酶（Cas9 nickase）和2條sgRNA對目的基因進(jìn)行編輯可以極大地降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[12-13]，這一系統(tǒng)被稱為CRISPR/Cas9n系統(tǒng)。

本研究利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)，構(gòu)建在同一載體中同時表達(dá)2條sgRNA和Cas9切刻酶以及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染豬的成纖維細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選獲得表達(dá)GFP的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)GFP陽性的細(xì)胞至單個細(xì)胞長成細(xì)胞克隆點(diǎn)，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）和DNA測序鑒定獲得對CD163基因進(jìn)行編輯的細(xì)胞克隆點(diǎn)。以CD163基因編輯的細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆和胚胎移植，以期獲得正常存活的CD163基因編輯豬。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PX461載體（購自Addgene公司，貨號48140），pMD18-T載體（購自TaKaRa公司）；宿主菌大腸埃希菌DH5α（購自TaKaRa公司）；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；序列測定由上海睿迪生物科技有限公司完成；LA Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、PBS和胎牛血清購自Life Technologies公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟參考《分子克隆》（第3版）進(jìn)行。

1.2 豬CD163基因編輯載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中豬CD163基因的DNA序列（NC_010447.5）和mRNA序列（NM_213976.1），在CD163基因的第7外顯子上設(shè)計(jì)2條sgRNA（表1中下劃線部分的序列），2條sgRNA的正義鏈和反義鏈（表1）分別由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 豬CD163基因的sgRNA合成序列Table1 sgRNA sequence of porcine CD163 gene

每條sgRNA的單鏈正義鏈和反義鏈退火后形成小的雙鏈DNA分子，直接連接到經(jīng)過BbsⅠ酶切的PX461載體上，構(gòu)建完成同時表達(dá)1條sgRNA和Cas9切刻酶以及GFP的載體（PX461-C161和PX461-C185）。

以 PX461-C161為模板，sgRNA-F（GAGGG CCTATTTCCCATGATTCC）和 sgRNA-R（GGGGT ACCTCTAGAGCCATTTG）為引物，利用PCR擴(kuò)增含有U6啟動子的sgRNA-C161序列，并連接到pMD18-T載體上，再經(jīng)過KpnⅠ酶切后獲得兩端含有KpnⅠ酶切位點(diǎn)的U6-sgRNA-C161序列，然后連接到經(jīng)過KpnⅠ酶切的PX461-C185載體上，構(gòu)建完成同時表達(dá)sgRNA C161、C185以及Cas9切刻酶和GFP的載體PX461-C185+C161。同時表達(dá)2條針對豬CD163基因的sgRNA和Cas9切刻酶以及GFP的載體構(gòu)建過程如圖1所示。

圖1 豬CD163基因編輯載體的構(gòu)建流程Fig.1 Construction process of porcine CD163 gene edit vector

1.3 豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及基因編輯細(xì)胞克隆點(diǎn)的篩選和鑒定

接種豬胎兒成纖維細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含有15%胎牛血清的DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基中培養(yǎng)至50%～70%匯合度時，按照說明書要求，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將PX461-C185+C161載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，經(jīng)0.1%胰酶消化后，用流式細(xì)胞儀分選出表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞，在含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)9～12 d至長出明顯的單細(xì)胞克隆點(diǎn)。

將生長狀態(tài)良好的單細(xì)胞克隆點(diǎn)細(xì)胞用0.1%胰酶消化后轉(zhuǎn)接到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿需要傳代時，取1/10的細(xì)胞裂解后作為模板進(jìn)行PCR，用于鑒定分析CD163基因的編輯情況；剩余細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)至長滿，然后凍存到液氮中。用來鑒定細(xì)胞克隆點(diǎn)CD163基因編輯情況的引物如表2所示。

由于用來分析鑒定的細(xì)胞數(shù)比較少，所以細(xì)胞裂解物先用CD163-39F和CD163-527R引物進(jìn)行PCR，沒有擴(kuò)增出特異性條帶的細(xì)胞裂解物再分別用dEX7-Fb/Rb和dEX7-Fs/Rs 2對引物進(jìn)行巢式PCR。PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接到pMD18-T載體上，挑選10個陽性菌落測序。將測序獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的豬CD163基因序列進(jìn)行比對，獲得CD163雙等位基因都進(jìn)行了編輯的細(xì)胞克隆點(diǎn)。

1.4 CD163基因編輯克隆豬的生產(chǎn)和鑒定

以CD163雙等位基因編輯的細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，選用發(fā)情良好、體型較好的母豬為受體，將重構(gòu)1 d后的胚胎移植到自然發(fā)情后1 d的母豬輸卵管中，每頭受體母豬移植150～240枚。胚胎移植28～30 d后，利用超聲波檢測妊娠情況，妊娠母豬30 d后每月檢測一次，跟蹤胎兒發(fā)育情況，調(diào)整飼養(yǎng)管理，直至基因編輯克隆豬出生。取克隆豬的耳組織提取基因組DNA，用dEX7-Fs/Rs引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，連接到pMD18-T載體上，挑選10個陽性菌落測序。將測序獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的豬CD163基因序列進(jìn)行比對，記錄CD163基因的編輯情況。

表2 豬CD163基因編輯鑒定引物Table2 Primersfor porcine CD163 geneedit identification

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CD163基因編輯載體的構(gòu)建分析

為了方便細(xì)胞轉(zhuǎn)染和保證Cas9切刻酶與2條sgRNA的共表達(dá)，本研究構(gòu)建了在同一載體中同時表達(dá)2條sgRNA和Cas9切刻酶以及綠色熒光蛋白GFP的質(zhì)粒PX461-C185+C161，經(jīng)過測序確定了該載體上包含完整的Cas9切刻酶、綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)序列、U6啟動子和2條sgRNA的表達(dá)序列（圖1）。

2.2 豬CD163基因編輯細(xì)胞克隆點(diǎn)的篩選和鑒定

豬胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染PX461-C185+C161載體后，經(jīng)過流式細(xì)胞儀的分選和單細(xì)胞克隆點(diǎn)的培養(yǎng)，共獲得20個細(xì)胞克隆點(diǎn)。經(jīng)鑒定，其中2個細(xì)胞克隆點(diǎn)為CD163單等位基因編輯的細(xì)胞，16個細(xì)胞克隆點(diǎn)為CD163雙等位基因編輯的細(xì)胞，基因編輯效率達(dá)90%。

2.3 CD163基因編輯克隆豬的生產(chǎn)和鑒定結(jié)果

取6個細(xì)胞克隆點(diǎn)的細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆，最終獲得2頭存活的克隆豬，經(jīng)過PCR和DNA測序鑒定，這2頭克隆豬均為CD163基因編輯克隆豬（圖2），其CD163基因編輯情況如表3所示。

圖2 CD163基因編輯克隆豬Fig.2 CD163 gene-edited cloned pigs

表3 CD163基因編輯克隆豬的基因型Table3 Genotypes of CD163 gene-edited pigs

3 討論

據(jù)估計(jì)，我國養(yǎng)豬業(yè)每年由疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失占總成本的35%～50%，其中藍(lán)耳病對養(yǎng)豬業(yè)的危害居首位。藍(lán)耳病的感染率占我國生豬飼養(yǎng)量的40%～50%，母豬流產(chǎn)率8%～10%，死亡率通常為10%～15%。目前針對藍(lán)耳病沒有好的特效藥物，雖然疫苗的使用具有一定的預(yù)防效果，但對此類重大的病毒性傳染病的控制尚未取得實(shí)質(zhì)性突破，而且隨著免疫壓力和致病毒株的變異，反而使此類疾病的防控變得越來越復(fù)雜。從長遠(yuǎn)來看，利用基因工程手段獲得從遺傳本質(zhì)上抗藍(lán)耳病的豬是防控藍(lán)耳病最為有效的方法。培育抗藍(lán)耳病的新品種豬，不僅是我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的重大需求，也是全世界養(yǎng)豬業(yè)的需求，更將提升我國養(yǎng)豬業(yè)在抗病育種領(lǐng)域的國際地位。

近幾年，美歐科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)了對豬CD163基因的編輯，獲得的CD163基因編輯豬能夠正常存活且不會感染藍(lán)耳病[4-5]。然而，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)存在較高的脫靶效應(yīng)。為了減少脫靶效應(yīng)，本研究應(yīng)用的基因編輯技術(shù)是基于CRISPR/Cas9內(nèi)切酶系統(tǒng)改進(jìn)后的CRISPR/Cas9切刻酶系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于CRISPR/Cas9切刻酶系統(tǒng)通過2條sgRNA靶定目的基因，提高了基因編輯的特異性；同時，Cas9切刻酶的存在降低了對非目的基因進(jìn)行編輯的可能性[12-13]。利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的CD163基因編輯豬，除了CD163基因被編輯外不會引入其他任何外源基因，也不會對基因組上非CD163基因的區(qū)域進(jìn)行非特異的編輯，遺傳背景干凈清晰，極大地減少了后期轉(zhuǎn)基因安全評估工作。

此外，之前由于傳統(tǒng)的基因打靶策略效率極低，且豬中沒有可用的胚胎干細(xì)胞系，所以對豬的功能基因研究一直沒有實(shí)質(zhì)性突破?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)徹底解決了上述問題，使豬的功能基因研究不再那么困難，為人們研究豬的功能基因提供了可行的方法。

4 結(jié)論

本研究利用基于CRISPR/Cas9n系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功獲得了2頭正常存活的CD163基因編輯克隆豬，為培育抗藍(lán)耳病的新品種豬提供了一種可行的方法。

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