王佳堃，和文鳳

（浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州310058）

真菌作為降解木質(zhì)纖維素最有效的微生物類群，一直是挖掘高效纖維降解酶的核心微生物。新美鞭毛菌科（Neocallimastigaceae）是真菌界唯一營(yíng)專性厭氧的類群。自1975年ORPIN[1]發(fā)現(xiàn)厭氧真菌是瘤胃微生物的重要組成部分以來(lái)，厭氧真菌的分類和群落結(jié)構(gòu)、纖維素酶的多樣性一直是微生物學(xué)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在許多生境中均檢測(cè)到新美鞭毛菌科的存在，不再被誤認(rèn)為是僅存于草食動(dòng)物消化道中；其下的屬也由6個(gè)增至可分類的9個(gè)屬和12個(gè)尚未分類的類群。隨著真菌通用引物的使用，在反芻動(dòng)物瘤胃和草食動(dòng)物糞便中檢測(cè)出越來(lái)越多的非嚴(yán)格厭氧真菌。直接飼喂厭氧真菌和酵母均能改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，但在非外源添加情況下，非嚴(yán)格厭氧真菌在消化道中的作用尚未可知。為充分了解消化道中真菌的功能，本文就厭氧真菌的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、厭氧真菌的測(cè)定方法、草食動(dòng)物消化道真菌組成、非嚴(yán)格厭氧真菌在草食動(dòng)物消化道內(nèi)的作用及利用宏基因組學(xué)/宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究消化道內(nèi)真菌生理功能的瓶頸進(jìn)行了綜述。

1 厭氧真菌的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制

厭氧真菌可特化出氫化酶體和纖維小體結(jié)構(gòu)，提高厭氧環(huán)境下自身的能量供應(yīng)；也能特化出厚的細(xì)胞壁或孢子樣結(jié)構(gòu)增加對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)。然而進(jìn)食飼料后，厭氧真菌能迅速黏附/定殖在纖維上，但在這個(gè)過(guò)程中厭氧真菌如何防御氧的毒性尚不十分清楚。

1.1 氫化酶體的無(wú)氧代謝

線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場(chǎng)所，三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化都在線粒體內(nèi)完成。厭氧真菌沒(méi)有線粒體，更沒(méi)有線粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色素和氧化磷酸化途徑[2-3]，但厭氧真菌特有的氫化酶體，是一種雙層膜包裹的簡(jiǎn)單細(xì)胞器，內(nèi)含氫化酶[4]。蘋果酸在氫化酶作用下脫羧產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）、氫氣、二氧化碳和乙酸，提升了在厭氧情況下的供能效率[5-6]。鑒于氫化酶體與線粒體極其類似，被認(rèn)為是線粒體的厭氧衍生物，或線粒體和氫化酶體起源于同一種兼性厭氧細(xì)菌[7]。

1.2 纖維小體提高纖維降解效率

纖維素酶是指能夠水解纖維素β-1，4-D-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素的水解需要酶預(yù)先結(jié)合到纖維素上，形成酶-底物二元復(fù)合物。好氧細(xì)菌和真菌不附著或微弱地附著纖維素，產(chǎn)生的酶很少形成穩(wěn)定的高分子復(fù)合物，獨(dú)立的胞外酶（外切β-1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-葡萄糖苷酶）具有自己的結(jié)合域和催化域，協(xié)同降解纖維素。而厭氧微生物由于糖酵解供能效率低，所以特化出了纖維小體（cellulosome），在有限ATP的情況下，增加與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)力，提高纖維物質(zhì)的降解效率。纖維小體是多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定-黏附機(jī)制形成的穩(wěn)定高分子的多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)，能高效降解纖維類物質(zhì)[8]，為糖酵解途徑輸送更多的葡萄糖。厭氧真菌雖然已具有氫酶體，但在進(jìn)化過(guò)程中仍保留了纖維小體結(jié)構(gòu)。

1.3 特化出的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和基因組對(duì)有氧損傷的防御

氧對(duì)于厭氧真菌具有毒副作用，但厭氧真菌的繁殖體可在糞便中存活1年之久[9]。NIELSEN等[10]發(fā)現(xiàn)，奶牛糞便中黏附在植物顆粒上的孢子有一層厚厚的壁，這些真菌孢子經(jīng)過(guò)洗滌、干燥和在空氣中貯存數(shù)天后，仍可再生出單中心真菌，但是瘤胃中黏附在植物顆粒上的孢子在有氧情況下卻不能再生，因此他們推測(cè)，厭氧真菌在通過(guò)胃腸道時(shí)發(fā)生了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化，使其抵抗氧的毒性。TRINCI等[11]進(jìn)一步指出，在有氧條件下于干燥的羊糞中可以分離到厭氧真菌，且不受貯存時(shí)間和真菌種類的影響，但在有氧且保持濕潤(rùn)的條件下，不論是在20℃還是39℃的羊糞中都無(wú)法分離到厭氧真菌，為此推斷干燥過(guò)程可以啟動(dòng)真菌的防御結(jié)構(gòu)。BROOKMAN等[12]也觀察到一種孢子樣結(jié)構(gòu)，推測(cè)這種結(jié)構(gòu)可使厭氧真菌在腸道厭氧環(huán)境下形成一種靜止?fàn)顟B(tài)，有利于生長(zhǎng)時(shí)再出芽。然而，這些均不能解釋厭氧真菌在新進(jìn)食纖維上快速定殖的原理。NATVIG[13]發(fā)現(xiàn)，在兼性的或耐氧的厭氧菌細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶的活性都低于需氧菌，而且確認(rèn)壺菌綱的真菌無(wú)過(guò)氧化氫酶，但新美鞭毛菌科是否缺少上述酶系尚未可知。YOUSSEF等[3]通過(guò)對(duì)根囊鞭菌屬（Orpinomyces）的C1A菌株進(jìn)行單菌測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在100.95 Mb的基因組中，G+C含量?jī)H占17%，存在73.1%的非編碼間隔區(qū)，4.9%的微衛(wèi)星重復(fù)序列。這種特化出的基因組與防御氧損傷有何關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。

2 厭氧真菌的測(cè)定方法

厭氧真菌可以通過(guò)菌體計(jì)數(shù)和酶活測(cè)定等方式定量，通過(guò)顯微技術(shù)分類。然而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核糖體18S/28SrRNA基因和轉(zhuǎn)錄組間隔區(qū)（internal spacer region,ITS）的分子標(biāo)記技術(shù)為厭氧真菌數(shù)量和區(qū)系的研究提供了更為精準(zhǔn)的手段，使厭氧真菌的研究逐漸深入。

2.1 顯微鏡觀察法

顯微鏡很容易區(qū)分真菌的根狀和球狀形態(tài)，是測(cè)定真菌生長(zhǎng)狀態(tài)的最直接方法，但是區(qū)分單中心和多中心則需要采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）或雙苯酰亞胺等Hoechst染料進(jìn)行DNA熒光標(biāo)記。但即便使用熒光標(biāo)記，顯微鏡技術(shù)也很難區(qū)分梨囊鞭菌屬（Piromyces）和新美鞭菌屬（Neocallimastix）這2類單中心真菌。厭氧真菌也可依據(jù)鞭毛形態(tài)分為單鞭毛和多鞭毛，但由于根囊鞭菌屬（Orpinomyces）和厭氧鞭菌屬（Anaeromyces）較少釋放游離孢子，所以也很難在顯微鏡下鑒別這2種孢子的鞭毛類型。Oontomyces和Buwchfawromyces的形態(tài)與梨囊鞭菌屬極其相似，在顯微鏡下很難區(qū)分。Pecoramyces也一度被稱作Orpinomyces sp.C1A[3]，很難將其與根囊鞭菌屬的真菌進(jìn)行區(qū)分。此外，在熒光顯微鏡下植物有自發(fā)光現(xiàn)象，干擾了食糜碎片中真菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的識(shí)別。在表1中列出了已分離鑒定出的9個(gè)厭氧真菌屬的形態(tài)特征。

表1 9個(gè)厭氧真菌屬的形態(tài)特征Table1 Morphological characteristics of ninerecognized anaerobic fungal genera

2.2 組學(xué)技術(shù)

組學(xué)技術(shù)的不斷完善推動(dòng)了真菌定量和區(qū)系分析的精準(zhǔn)化。真菌核糖體內(nèi)18SrDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1（internal transcribed spacer,ITS1）、5.8S rDNA、ITS2、28S rDNA、基因間隔區(qū) 1（intergenic spacer region,IGS1）、5SrDNA和IGS2依次串聯(lián)形成多拷貝的結(jié)構(gòu)（圖1）[14]?；诤颂求w大小亞基的結(jié)構(gòu)，研究人員設(shè)計(jì)出不同的引物用于熒光定量和真菌區(qū)系分析。ITS1和28SrDNA的D1/D2區(qū)域序列聯(lián)用已成為真菌區(qū)系精細(xì)分析的首選。

圖1 厭氧真菌核糖體操縱子結(jié)構(gòu)示意圖[14]Fig.1 Schematic diagram of rrnoperon in anaerobic fungi[14]

2.2.1 熒光定量分析

18SrRNA基因由于其保守程度高達(dá)97%，所以主要用于厭氧真菌的定量。到目前為止，厭氧真菌的4對(duì)定量引物分別由以下研究人員設(shè)計(jì)提出。1）DENMAN等[15]：擴(kuò)增18SrRNA基因3'端和ITS1 5'端共120 bp的區(qū)域；2）EDWARDS等[16]：擴(kuò)增5.8S rRNA基因110 bp的區(qū)域；3）LI等[17]、KITTELMANN等[18]：擴(kuò)增從18SrRNA基因啟始部位到部分5.8S rRNA基因終止的433 bp區(qū)域；4）DOLLHOFER等[19]：擴(kuò)增18SrRNA基因475 bp的長(zhǎng)度區(qū)域。真菌DNA和生物量間的比值隨真菌生長(zhǎng)階段不斷變化，雖然LWIN等[20]利用9株厭氧真菌證實(shí)ITS1基因拷貝數(shù)與生物量和游動(dòng)孢子計(jì)數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)，但上述4對(duì)引物僅能通過(guò)基因拷貝數(shù)來(lái)描述和對(duì)比不同樣品或生境中厭氧真菌豐度的差異，不能真實(shí)地反映厭氧真菌的生物量。

2.2.2 多樣性分析

ITS不轉(zhuǎn)錄成RNA，在進(jìn)化過(guò)程中受到的選擇壓力小，容易產(chǎn)生變異，在絕大多數(shù)真菌的不同種類之間表現(xiàn)出廣泛的多態(tài)性，是目前公認(rèn)的真菌分子鑒定和多樣性研究的分子標(biāo)記物。ITS1和ITS全長(zhǎng)序列（ITS1-5.8SrDNA-ITS2）已在變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP）及宏基因組學(xué)（metagenomics）中成功應(yīng)用，而且隨ITS擴(kuò)增引物的完善，使厭氧真菌的分類更精準(zhǔn)，厭氧真菌的分類也增至6個(gè)屬，以及12個(gè)以上尚未命名的屬[21-24]。

由于ITS變異頻率高，在ITS內(nèi)經(jīng)常有插入和缺失，所以同一種的不同菌株可能會(huì)有ITS不一致的現(xiàn)象。為了保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確，TAN等[25]推薦將18S、28S和ITS 3個(gè)RNA基因區(qū)域整合測(cè)序。DAGAR等[26]在利用ITS1/ITS4引物[27]擴(kuò)增ITS（部分18S、完整的ITS1、5.8S、ITS2和部分28S序列）、利用NL1/NL4引物[28]擴(kuò)增28SrDNA的D1/D2區(qū)域序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，在印度駱駝前胃中分離出的2株形態(tài)與梨囊鞭菌屬相似的厭氧真菌與梨囊鞭菌屬的親緣距離很遠(yuǎn)，但與厭氧鞭菌屬的親緣關(guān)系較近，將其命名為Oontomyces新屬（圖2）[31]。CALLAGHAN等[29]同樣利用28SrDNA的D1/D2區(qū)域（DAGAR等[28]的引物NL1/NL4）及 ITS1序列（EDWARDS等[16]的引物GM1/MN106擴(kuò)增產(chǎn)物跨ITS1和ITS2）鑒別出西威爾士的水牛、綿羊、奶牛和馬的糞便中另一個(gè)形態(tài)與梨囊鞭菌屬相似，但與厭氧鞭菌屬親緣關(guān)系較近的Buwchfawromyces屬（圖2）[31]。WANG等[30]在上述研究的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地比較了ITS1、ITS全長(zhǎng)序列及28S rDNA D1/D2區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)厭氧鞭菌屬和Oontomyces的ITS1無(wú)明顯的進(jìn)化距離，ITS全長(zhǎng)無(wú)法區(qū)分根囊鞭菌屬的菌株，而核糖體大亞基不存在上述問(wèn)題，因此推薦用核糖體大亞基進(jìn)行厭氧真菌的分類鑒定。HANAFY等[31]結(jié)合鏡檢和28SrDNA測(cè)序，鑒別出從牛和羊胃中分離的4株厭氧真菌為Pecoramyces屬。

3 草食動(dòng)物消化道真菌組成

反芻動(dòng)物的瘤胃、部分草食動(dòng)物的前胃和盲腸的pH值接近中性，為厭氧細(xì)菌和真菌提供了良好的生存條件。但畜種和消化道類型、日糧結(jié)構(gòu)均影響動(dòng)物消化道真菌的組成。

3.1 畜種和消化道類型的影響

LIGGENSTOFFER等[21]利用ITS1序列，系統(tǒng)比較了叉角羚科、?？?、鹿科、長(zhǎng)頸鹿科等反芻動(dòng)物與前胃發(fā)酵的非反芻動(dòng)物袋鼠科、偽反芻動(dòng)物駱駝科和河馬科以及后腸發(fā)酵動(dòng)物馬科、美洲鬣蜥科和犀科共29種動(dòng)物糞便中厭氧真菌的組成（圖3），發(fā)現(xiàn)厭氧真菌的OTU數(shù)在4種發(fā)酵類型的動(dòng)物糞便中無(wú)顯著差異，但在后腸發(fā)酵動(dòng)物糞便中的厭氧真菌組成明顯有別于前胃發(fā)酵類型，在黑犀牛糞便中99.9%的真菌源自于梨囊鞭菌屬，斑馬糞便中99.9%的真菌源自于NG1屬，小型驢NG3占98.8%，索馬里野驢中新美鞭菌屬、盲腸鞭菌屬、NG1和NG3分別占44.9%、15%、4.7%和34.7%。在前胃發(fā)酵動(dòng)物糞便中新美鞭菌屬、梨囊鞭菌屬和盲腸鞭菌屬是優(yōu)勢(shì)真菌屬，但同一科的不同動(dòng)物間也存在豐度差異。

本課題組利用BUéE等[32]的引物擴(kuò)增ITS1序列，分析了水牛、奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物，兔盲腸內(nèi)容物，馬和麋鹿糞便中真菌的多樣性，并利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）測(cè)定了其菌群數(shù)量[33]；同時(shí)，利用糖苷水解酶家族10和11驗(yàn)證了消化道內(nèi)真菌的纖維分解功能[34]。研究發(fā)現(xiàn)，在草食動(dòng)物消化道中存在大量好氧真菌，無(wú)論這些真菌是一過(guò)性還是長(zhǎng)期定殖，它們?cè)谙乐卸夹惺沽艘欢ǖ睦w維消化功能，且酵母綱所占比例高，具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值。

ABR?O等[35]比較了閹公牛、奶牛和犢牛在進(jìn)食同種高木質(zhì)化臂形草8 h后瘤胃內(nèi)真菌區(qū)系組成的差異，發(fā)現(xiàn)厭氧真菌在閹公牛瘤胃樣品中廣泛分布，而在奶牛瘤胃樣品中非嚴(yán)格厭氧真菌量高于閹公牛，且主要是一些多中心的真菌；在閹公牛和奶牛瘤胃中最易檢出的是曲霉屬真菌，而在犢牛瘤胃樣品中未檢出厭氧真菌。在新生和哺乳動(dòng)物糞便中未分離到厭氧真菌，而在成年動(dòng)物糞便中分離到了厭氧真菌[36]，說(shuō)明厭氧真菌通過(guò)母親的舔食或糞便隨唾液或食物進(jìn)入瘤胃并且存活下來(lái)。在不同畜種消化道中厭氧真菌的組成雖然不同，但是厭氧真菌在宿種間轉(zhuǎn)移卻有可能，如ORPIN[37]就成功地將馬和鹿消化道中的厭氧真菌轉(zhuǎn)移給了綿羊。

圖2 草食動(dòng)物消化道內(nèi)厭氧真菌28Sr RNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[31]Fig.2 Phylogenetic tree of 28SrRNA gene sequence of anaerobic fungiin the digestive tract of herbivores[31]

圖3 草食動(dòng)物消化道內(nèi)厭氧真菌組成[21]Fig.3 Composition of anaerobic fungiin thedigestivetract of herbivores[21]

3.2 日糧的影響

ISHAQ等[38]利用WHITE等[39]的引物擴(kuò)增ITS1序列，通過(guò)高通量分析發(fā)現(xiàn)，除新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬、梨囊鞭菌屬外，在奶牛瘤胃中存在著近50%的非嚴(yán)格厭氧真菌。奶牛日糧由粗料型轉(zhuǎn)為高精料型誘導(dǎo)亞臨床酸中毒后，在奶牛瘤胃中新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬、梨囊鞭菌屬厭氧真菌的相對(duì)豐度顯著降低，而翹孢霉屬（Emericella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、紅曲霉屬（Monascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母（Candida）等相對(duì)豐度顯著增加。

LIMA等[40]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)犢前飼喂高纖維低能量日糧，而產(chǎn)后飼喂低纖維高能量日糧，產(chǎn)前奶牛瘤胃中真菌的豐度高于產(chǎn)后。產(chǎn)犢前后，奶牛除經(jīng)歷日糧變化外，也經(jīng)歷了生理上的巨大變化，但兩者影響真菌的權(quán)重尚不可知。BOOTS等[41]試驗(yàn)顯示，6%的豆油可顯著降低厭氧真菌的豐度，但日糧精粗比由50∶50增至90∶10并未顯著影響厭氧真菌的豐度。KOLK等[42]利用銀合歡研究了濃縮單寧對(duì)山羊瘤胃真菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)飼喂?jié)饪s單寧的前10 d，瘤胃真菌受到抑制，飼喂15 d時(shí)真菌數(shù)量增長(zhǎng)4倍，但隨后真菌數(shù)量又開(kāi)始下降，在飼喂30 d時(shí)瘤胃真菌數(shù)量與未飼喂銀合歡的山羊相比無(wú)顯著差異。

利用熒光定量PCR技術(shù)，我們?cè)赗NA水平上對(duì)采食前后共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的瘤胃好氧和厭氧菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)采食前每克瘤胃內(nèi)容物中總真菌、子囊菌門（Ascomycota）真菌、新美鞭毛菌門（Neocallimastigomycota）真菌、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）真菌的拷貝數(shù)分別高達(dá)1×109、1×1×107、1×106和1×107，進(jìn)食后1 h總真菌數(shù)有上升趨勢(shì)，子囊菌門和擔(dān)子菌門顯著上升，3 h后上述真菌均有所下降，但新美鞭毛菌門真菌數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，未隨采食時(shí)間的變化出現(xiàn)顯著波動(dòng)[43]。

4 非嚴(yán)格厭氧真菌在草食動(dòng)物消化道內(nèi)的作用

利用真菌通用引物，在草食動(dòng)物消化道內(nèi)越來(lái)越多的非嚴(yán)格厭氧真菌被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其中包括子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門（Zygomycota），而且在瘤胃中子囊菌門相對(duì)豐度可高達(dá)22.6%[44]。直接飼喂瘤胃厭氧真菌可以提高反芻動(dòng)物的采食量、乳質(zhì)量和乳產(chǎn)量等[45-46]。酵母（Saccharomycetes）作為子囊菌門中的重要成員，飼喂活酵母可促進(jìn)瘤胃微生物數(shù)量和活力，改善產(chǎn)肉和產(chǎn)奶性能也近乎是公認(rèn)的結(jié)果[47]，尤其是在高精料日糧下，活酵母可以加速瘤胃乳酸代謝，穩(wěn)定瘤胃pH值[48]。CHAUCHEYRASDURAND等[49]的研究證實(shí)，飼喂活酵母可改善瘤胃的發(fā)酵特性，增強(qiáng)瘤胃微生物對(duì)纖維飼料的定殖，進(jìn)而提高微生物對(duì)纖維飼料的降解能力。PINLOCHE等[50]和ALZAHAL等[51]也證實(shí)活酵母可穩(wěn)定瘤胃的pH值，降低氧化還原電位和乳酸濃度，提高纖維分解菌（纖維桿菌屬Fibrobacter和瘤胃球菌屬Ruminococcus）、乳酸利用菌（巨型球菌屬M(fèi)egasphaera和月形單胞菌屬Selenomonas）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度，降低普雷沃菌（Prevotella）、互養(yǎng)球菌屬（Syntrophococcus）、光崗菌屬（Mitsuokella）的相對(duì)豐度。而且，添加酵母能增加瘤胃真菌的豐度。在高纖維日糧下，干酵母可增加Lewia、新美鞭菌屬和莖點(diǎn)霉屬（Phoma）的豐度，降低鏈格孢屬（Alternaria）、假絲酵母屬（Candida）、根囊鞭菌屬和梨囊鞭菌屬的豐度。

5 宏基因組學(xué)/宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究消化道內(nèi)真菌生理功能的瓶頸

宏基因組學(xué)/宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在研究瘤胃微生物代謝和開(kāi)發(fā)瘤胃微生物資源上展示出強(qiáng)勁的優(yōu)勢(shì)。但由于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBIBLAST、InterProScan、OrthoMcL、KEGG、TrEMBL和SwissProt）缺少真菌的信息，所以導(dǎo)致真菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后能夠得以注釋的基因往往不到50%[52]。在消化道微生物區(qū)系中存在細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)，且細(xì)菌占比高于真菌，增加了在消化道微生物區(qū)系中獲取足量的真菌DNA/RNA用于宏基因組/宏轉(zhuǎn)錄組分析的難度。FERRER等[53]對(duì)奶牛瘤胃宏基因組文庫(kù)進(jìn)行了功能篩選，發(fā)現(xiàn)在可識(shí)別的編碼序列中厭氧真菌僅占了5%；而DAI等[54]發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物在宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中厭氧真菌的序列數(shù)僅占總序列數(shù)的1%。

6 小結(jié)

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使消化道中真菌的定量和區(qū)系分析越來(lái)越精準(zhǔn)，而且越來(lái)越多的真菌酶基因被擴(kuò)增和異源表達(dá)，開(kāi)發(fā)出新酶用于工業(yè)生產(chǎn)。但消化道中真菌的生理、厭氧真菌與非嚴(yán)格厭氧真菌的互作等尚未清楚，宏基因組學(xué)/宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)必然是有利的推手。因此，突破宏基因組學(xué)/宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究消化道內(nèi)真菌生理功能的瓶頸是今后真菌研究的重中之重。

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