孫婧文，呂立堂，趙德剛

(1.貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

花青素(anthocyanin)是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮類化合物，也是植物的主要呈色物質(zhì)。研究表明，攝入花青素能夠降低心血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和癌癥的發(fā)病率[1-3]?；ㄇ嗨剡€有抗氧化、抗增生和減輕肝機能障礙及抑制腫瘤細胞發(fā)生等多種生理功能[4-5]。目前已從葡萄、擬南芥、矮牽牛、紫甘薯等植物中克隆了大量與花青素生物合成代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因。Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子是花青素合成途徑中的調(diào)節(jié)基因，該基因通過調(diào)節(jié)花色素苷的合成來決定葡萄漿果的顏色[6]。花青素的生物活性研究已經(jīng)有很多成果，也有研究者嘗試在一些花青素含量比較低的植物中轉(zhuǎn)入花青素合成相關(guān)基因，增加花青素的表達，其結(jié)果是植株抗氧化能力得到了提升[7]。本次研究通過轉(zhuǎn)花青素合成轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2并對煙草生理特征進行測定，探究Vlmyb2基因的表達對植株生長的是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為煙草。質(zhì)粒主要包含有目的基因Vlmyb2和篩選基因NPTⅡ (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、GUS(β-葡萄糖苷酸酶基因)報告基因表達元件的植物表達載體，植物表達載體由本實驗室構(gòu)建。農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化煙草。參照姚新轉(zhuǎn)等[7-8]煙草組織培養(yǎng)方法，直到抗性苗長至4～5 cm時，移栽于營養(yǎng)土中生長，期間不定期追肥。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測

經(jīng)卡那霉素篩選的煙草生長至4～6葉期時，剪取葉片進行GUS組織化學染色，鑒定后，按照天根生化科技(北京)有限公司新型植物總DNA提取試劑盒步驟分別提取GUS染色陽性煙草和野生型煙草DNA，用于PCR鑒定[8]。

1.4 花青素相對含量的測定

參照張志良[9]的測定方法。

1.5 葉綠素含量的測定

參照張志良[9]的測定方法。

1.6 光合速率測定

選取轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株共計10株，每株測量從頂端往下第三片成熟葉片。選擇晴朗無風的天氣，在上午9點～11點，利用美國Li-6400便攜式光合儀，選取植株頂端往下第三片全展成熟葉片測定其凈光和速率(Pn)、蒸騰速率(trmmol)、胞間CO2和氣孔導(dǎo)度(Cond)4個指標，每片葉片測3個重復(fù)。

1.7 細胞學觀察

參照付洪蘭[10]的測定方法取生長60 d左右的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草煙草成熟葉片做細胞學觀察，轉(zhuǎn)基因和野生型各選取3株，每株3個重復(fù)，在樣品觀察時每個重復(fù)選取5個視野，用5-3400N掃描電鏡對煙草葉片表面腺毛形態(tài)、腺毛密度進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR鑒定

對33株煙草抗性植株的葉片進行GUS組織化學染色，結(jié)果顯示抗性植株葉片顯現(xiàn)藍色，而非轉(zhuǎn)基因植株葉片并未染出藍色(圖1)。對GUS呈陽性的植株進行Vlmyb2基因的PCR擴增，電泳結(jié)果顯示，質(zhì)粒對照和抗性植株均能擴增得到419 bp的特異條帶，非轉(zhuǎn)基因植株沒有擴增出特異條帶(圖2)，說明外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，初步證明獲得了轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草植株。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

注： M： DL1000; WT： 陰性對照; P： 質(zhì)粒陽性對照;1～5： 不同抗性植株

2.1 花青素含量的測定

以野生型煙草植株作為對照，選取轉(zhuǎn)V1myb2基因的煙草植株8個不同株系進行花青素含量的測定。轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草的花青素的表達量與野生型植株相比有了較大的提高。不同株系的花青素表達量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右?；ㄇ嗨睾恐械鹊闹仓闠P2、TP3 和TP6是對照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的2.55和6.77倍。

2.2 花青素含量的測定

以野生型煙草植株作為對照，選取轉(zhuǎn)Vlmyb2基因的煙草植株8個不同株系進行花青素含量的測定。轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草的花青素的表達量與野生型植株相比有了較大的提高。不同株系的花青素表達量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右?；ㄇ嗨睾恐械鹊闹仓闠P2、TP3 和TP6是對照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的2.55和6.77倍。

2.3 轉(zhuǎn)Vlmyb2 基因?qū)煵萑~片中葉綠素含量的影響

由圖3和圖4可知：花青素含量高的TP4，TP5和TP7，3個轉(zhuǎn)基因株系，其葉綠素總含量在0.8775～1.048 mg/g之間，是所有株系中葉綠素含量中最低的3株。而葉綠素含量較大的WT和TP8株系中，其花青素相對含量低于0.1，為所有株系中較低的。由此可知，花青素的積累總是伴隨著葉綠素含量的降低，這與劉國君[10]在研究小蘋果不同季節(jié)、不同時期的葉綠素，花青素含量的結(jié)果一致。受到花青素影響較大的是葉綠素a，而葉綠素b的含量影響不大，葉綠素a作為反應(yīng)中心色素的只是很少一部分。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

綜上，本次試驗中，在花青素相對含量高于0.494，葉綠素含量低于1.329 mg/g的植株中，花青素與葉綠素呈現(xiàn)出較為明顯的線性反比關(guān)系。而當花青素含量低于0.494，葉綠素含量高于1.329 mg/g時這種關(guān)系并不明顯。

2.4 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片光合作用的影響

轉(zhuǎn)花青素轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2后的植株葉綠素含量受到了影響，而葉綠素又是植物光和作用途徑中重要的一類物質(zhì)。為了探究葉片中葉綠素含量降低后是否對植株的光和作用是否有影響，使用美國Li-6400便攜式光合儀對植株的凈光和速率(Pn)、蒸騰速率(trmmol)、氣孔導(dǎo)度(Cond)和胞間CO2四個指標(圖5～圖8)進行了測定，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄因子花青素的超表達對煙草葉片的光合速率有一定的影響。由于不同株系間存在著差別，從總體的趨勢來看，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均低于野生型葉片，而胞間CO2的濃度稍高于對照葉片，所以轉(zhuǎn)基因植株的光合效率低于野生型植株。但是，從測定數(shù)據(jù)上來看，不同株系間光合效率存在著差異，有的株系與野生型煙草相比變化并不明顯或者沒有變化，說明Vlmyb2基因調(diào)節(jié)花青素結(jié)構(gòu)基因在煙草中超表達會降低植株的光合效率，但降幅并不顯著，對植株正常生長沒影響。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

圖5 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片凈光合速率的影響Fig.5 Effect of Vlmyb2 gene on net photosynthetic rate >of Vlmyb2 transgenic tobacco leaves

圖6 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片氣孔導(dǎo)度的影響
Fig.6 Effect ofVlmyb2 gene on stomatal conductance of transgenic tobacco leaves

圖7 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片胞間CO2濃度的影響Fig.7 Effect of Vlmyb2 gene on intercellular CO2concentration of transgetic tobacco leaves

圖8 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片蒸騰速率的影響Fig.8 Effect of Vlmyb2 gene on transpiration rate of transgenie tobacco leaves

2.5 煙草腺毛的細胞學分析

葉面腺毛是葉片表皮細胞特化而來的多細胞結(jié)構(gòu)，采用掃描電鏡對轉(zhuǎn)基因的植株與對照的纖毛數(shù)量觀察。結(jié)果如下：反面腺毛多于正面腺毛(表1)，這與李鵬飛[11]的研究成果相符合?；ㄇ嗨睾扛叩闹仓?圖9A)，不論正面還是背面，其密度都高于WT約23%，差異達到顯著性。而花青素中等含量的植株TP3與對照的水平相當，相差不超過5%(圖9B和圖10B)?；ㄇ嗨睾康偷闹仓闠P1的植株其腺毛密度又低于對照組大約15%。這表明，轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2花青素的表達對煙草葉片腺毛的密度產(chǎn)生了的影響，高表達V1myb2基因促進腺毛數(shù)量的增加，低表達Vlmyb2基因腺毛數(shù)量減少。

表1 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草單位面積內(nèi)腺毛根數(shù)平均值Tab.1 The average value of wild type and transgenic tobacco glandular hairs within the unit area

注：A：野生型；B，C，D：轉(zhuǎn)基因

注：A，B，C：轉(zhuǎn)基因；D：野生型

3 結(jié)論與討論

長期以來，光和色素的含量被認為與光和速率有直接的關(guān)系，本實驗中，出現(xiàn)葉綠素的含量很低的植株光和速率沒有低于對照太多，有以下幾種可能：首先，受到花青素表達影響的大多是葉綠素a，而葉綠素b含量受到的影響不大，葉綠素a作為反應(yīng)中心色素的只是很少一部分。根據(jù)許曉明等[12]的研究，可以認為花青素的表達并沒有影響到反應(yīng)中心色素。甚至有可能是促進了電子的傳遞，因而光和速率并沒有受到太大的影響。進行測定的時間是在當日的11點左右，氣溫已經(jīng)很高，并且光照很強。因此可能部分植株的光和速率已經(jīng)開始受到抑制，而根據(jù)王美玲等[13]研究，葉片中的花青素有抵御高溫的作用，因此，可以認為花青素表達高的植株的光和速率還沒有受到抑制。而花青素表達量低的植株則已經(jīng)受到了高溫的抑制，導(dǎo)致光和速率下降。所以出現(xiàn)了花青素含量高的植株光和速率與對照差別不大的情況。

本試驗結(jié)果表明，Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子對煙草的腺毛數(shù)量有所影響，表達量高的植株腺毛數(shù)量得到了提升。試驗采用的材料在品種上相同，因此排除了腺毛密度不同是由于品種問題。試驗材料在農(nóng)場生長的過程中所有植株的環(huán)境一樣，所以也排除了環(huán)境因素的影響。劉翔等[14]研究表明，myb類轉(zhuǎn)錄因子與植株的腺毛生長發(fā)育相關(guān)，myb類轉(zhuǎn)錄因子的過量可以促進腺毛發(fā)育起始，產(chǎn)生異位腺毛，從而增加腺毛數(shù)量；同時也存在著減少腺毛生長的能力。因此推測，Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子同樣對腺毛的發(fā)育產(chǎn)生了影響，Vlmyb2的高表達促進腺毛發(fā)育。利用基因工程創(chuàng)制富含花青素的煙草新品種具有重要意義，但轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2 也引起了一些負效應(yīng)，如降低煙草植株光合效率等，但這些變化并不是很明顯。

通過本研究，Vlmyb2基因的表達可以對煙草的花青素合成起調(diào)節(jié)作用，為創(chuàng)造花青素高含量的煙草奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] Prior R L, Wu X. Anthocyanins： structural characteristics that result in unique metabolic patterns and biological activities[J].FreeRadicalResearch, 2006, 40(10):1014-1028.

[2] Springob K, Nakajima J, Yamazaki M,etal. Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J].Cheminform, 2003, 34(38):288.

[3] Bagchi D, Sen C K, Bagchi M,etal. Anti-angiogenic, antioxidant, and anti-carcinogenic properties of a novel anthocyanin-rich berry extract formula.[J].BiochemistryBiokhimiia, 2004, 69(1):75-80.

[4] 方忠祥, 倪元穎. 花青素生理功能研究進展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2001, 17(3):60-62.

[5] Ding M, Feng R, Wang S Y,etal. Cyanidin-3-glucoside, a natural product derived from blackberry, exhibits chemopreventive and chemotherapeutic activity[J].JournalofBiologicalChemistry, 2006, 281(25):17359.

[6] Kobayashi S, Ishimaru M, Hiraoka K,etal. Myb-related genes of the Kyoho grape (Vitis labruscana) regulate anthocyanin biosynthesis[J].Planta, 2002, 215(6):924.

[7] 趙 岑, 呂立堂, 趙德剛. 花青素調(diào)節(jié)基因VlmybA2對番茄遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學, 2012, 31(3):270-275.

[8] 姚新轉(zhuǎn), 呂立堂, 趙德剛.轉(zhuǎn)PSAG12-BAS1基因抑制煙草葉片的衰老[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2016, 24(12):1831-1838.

[9] 張志良.植物生理學實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社, 1990：190-191.

[10] 付洪蘭.實用電子顯微鏡技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社, 2004:40-58.

[11] 李鵬飛，周冀衡，邵 巖，等.不同烤煙品種成熟過程中各類腺毛密度的變化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2005，31(2)；133-137.

[12] 許曉明, 張榮銑, 唐運來. 低葉綠素含量對突變體水稻吸收光能分配特性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37(3):339-343.

[13] 王美玲, 艾希珍, 丁 飛,等. 紫甘藍和普通甘藍光合特性的比較[J]. 園藝學報, 2008, 35(4):547-552.

[14] 劉 翔, 左開井, 張 飛,等. MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物腺毛發(fā)育中的作用研究進展[J]. 上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版), 2010, 28(2):96-102.