熊 偉，王 雪，秦國兵，姚俊杰 ，2*，唐 鑫

(1. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

菲牛蛭 (PoecilobdellamanillensisLesson)是吸血類水蛭的一種，俗名金邊螞蟥、馬尼拉醫(yī)蛭，隸屬于無吻蛭目(Arhynchobdellida)醫(yī)蛭(Hirudinidae)牛蛭屬(PoecilobdellaWhitman)。由菲牛蛭唾液腺分泌的水蛭素是治療心腦血管疾病、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的重要藥物[1-3]。但過度的捕撈及生態(tài)環(huán)境惡化等諸多原因的影響，導(dǎo)致菲牛蛭資源急劇下降。因此，人們在探究菲牛蛭人工養(yǎng)殖方法，其中用配合飼料養(yǎng)殖也是人們關(guān)注的熱點。

近年來，人們從菲牛蛭攝食與生長、養(yǎng)殖方式、病害防治、繁殖[4-7]等方面做了很多工作，菲牛蛭的人工繁殖也取得成功。但是菲牛蛭還是采用粗放式的血液投喂，而血液的成本高、不易獲得、易腐敗、易污染、質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點，限制了菲牛蛭的規(guī)模化養(yǎng)殖。因此，研究菲牛蛭的人工配合飼料是急待解決的問題。2013年李軍[8]報道了菲牛蛭基礎(chǔ)飼料配方，并從生長及成活率兩個方面對其進行評價，其配方中蛋白含量是55%，而本實驗室研究小組提高飼料蛋白含量72%以上，更能滿足菲牛蛭的生長。所以，本研究采用雞血和自制配合飼料對菲牛蛭進行飼養(yǎng)，從水蛭素活性和抗氧化兩個方面對配合飼料做出評價，以期為規(guī)?；B(yǎng)殖菲牛蛭提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菲牛蛭購買于貴州蛭臻寶生物科技有限公司。隨機挑選大小均勻、體格健壯且體表無病，平均體重為(2.83±0.71)g，平均體長(5.33±0.54)cm的菲牛蛭幼苗。配合飼料主要成分為血球蛋白(NP-90)、血漿蛋白(NP-2002)、氯化鈉、L-精氨酸、維生素C(Vc)；血液采用菜市場收集的雞血(不加鹽、不加水)。實驗用水采用花溪河河水，pH7.5～7.8，水溫20～26℃，溶解氧6～9 mg/L。

1.2 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置2個組，配合飼料組和血液組，每個組3個重復(fù)。每個重復(fù)養(yǎng)殖箱規(guī)格為35 cm×25 cm×20 cm，養(yǎng)殖密度為40尾/箱。實驗組采用自制配合飼料灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，對照組采用雞血打成血漿灌入風(fēng)干豬血腸衣中投喂，養(yǎng)殖周期60 d，投喂頻率為3 d/次，每天換水量50%，停食1周采樣。

1.3 樣品制備

樣品采集：每個重復(fù)隨機抽取28尾水蛭，3尾直接放入-80℃冰箱凍存，用于水蛭素活性測定。剩余25尾置于冰上解剖取腸道及嗉囊組織，取樣菲牛蛭結(jié)構(gòu)圖參照文獻[9](取樣編號：配合飼料組，嗉囊記為“ss”，腸道記為“sc”；血液組，嗉囊記為“xs”，腸道記為“xc”)。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測定

組織蛋白(考馬斯亮藍、超氧化物歧化酶SOD(羥胺法)、過氧化氫酶CAT(可見光法)、丙二醛MDA(TBA法)，實驗用試劑盒均購買于南京建成生物工程研究院。水蛭素活性測定采用《中國藥典》2010版規(guī)定的測定方法及文獻[10]提供的方法。在數(shù)據(jù)體現(xiàn)時，在相應(yīng)標(biāo)號前增加指標(biāo)英文縮寫，如“SODss”代表配合飼料組嗉囊組織中超氧化物歧化酶的活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)(n=3)表示。運用LSD和Duncan's檢驗進行多重比較。p<0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 配合飼料基礎(chǔ)配方對比及營養(yǎng)組成

配合飼料配方主要原料組成見表1，血球蛋白(NP-90)比例4%，血漿蛋白(NP-2002)比例為5%，氯化鈉為2 g、L-精氨酸為0.17 5g、VC為0.2 g。加入純凈水到1000 ml，灌腸投喂。

表1 實驗飼料組成Tab.1 Composition of the experimental diets

2.2 配合飼料和血液對菲牛蛭水蛭素活性的影響

配合飼料和血液飼養(yǎng)對菲牛蛭水蛭活性影響見表1，血液組水蛭素活力為(76.172±0.391)U/g，配合飼料組水蛭素活力為(75.391±0.392)U/g。配合飼料組略低于血液組水蛭素活性，但在統(tǒng)計學(xué)意義上，差異性不顯著(P>0.05)。

表2 配合飼料和血液對菲牛蛭水蛭素活性的影響(U/g)Tab.2 The effect of compound feed and blood feed on the activities of hirudin in Poecilobdella manillensis

表2 配合飼料和血液對菲牛蛭水蛭素活性的影響(U/g)Tab.2 The effect of compound feed and blood feed on the activities of hirudin in Poecilobdella manillensis

餌料種類配合飼料血液水蛭素活性75.391±0.392a76.172±0.391a

注：不同字母表示測定數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 配合飼料和血液對菲牛蛭抗氧化指標(biāo)的影響

配合飼料和血液對菲牛蛭超氧化物歧化酶(SOD)的影響見圖1，配合飼料組腸道與血液組腸道SOD活力分別為(238.195±22.607)與(172.620±26.284) U/mgprot，差異顯著(P<0.05)；而配合飼料組嗉囊SOD顯著低于血液組嗉囊(P<0.05)，SOD值分別為(23.171±3.741)和(138.724±20.841) U/mgprot(P<0.05)。

注： 不同字母表示測定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P <0.05)

配合飼料與血液對菲牛蛭丙二醛(MDA)的影響如圖2所示，配合飼料組嗉囊組織MDA含量顯著低于血液組(P<0.05)，含量分別為(25.101±1.034)和(89.602±13.874)nmol/mgprot；配合飼料組腸道MDA含量稍低于血液組腸道，差異不顯著(P>0.05)，含量分別為(8.088±0.531)和(10.697±0.721)nmol/mgprot。

配合飼料和血液對菲牛蛭過氧化氫酶(CAT)活力影響見圖3，在腸道組織中，配合飼料組CAT顯著高于血液組(P<0.05)，CAT活力分別為(36.157±5.966)和(22.326±1.329)nmol/mgprot；而在嗉囊組織中，配合飼料組略低于血液組，活力分別為(1.399±0.161)和(2.161±0.014)nmol/mgprot，差異不顯著(P>0.05)。

注： 不同字母表示測定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P<0.05)

注： 不同字母表示測定數(shù)據(jù)存在顯著性差異( P<0.05)

3 結(jié)論與討論

3.1 NP-90、NP-2002比例分析

菲牛蛭配合飼料的研究處于起步階段，目前為止NP-90、NP-2002是菲牛蛭配合飼料主要蛋白來源。李軍[8]報道了NP-90比例為0.5%，NP-2002比例為3%，補齊其他成分，加入純水后2 L，干飼料中蛋白含量為55%，含水量為95.6%，個體增重率達19.91%，遠遠低于血液組的184.24%。這可能與蛋白質(zhì)基礎(chǔ)配方中蛋白質(zhì)需求量不足有關(guān)。而菲牛蛭營養(yǎng)成分蛋白質(zhì)含量84%(配合飼料養(yǎng)殖)～89%(野生菲牛蛭)[11]。在漁用配合飼料中， 蛋白質(zhì)含量是決定魚類生長快慢的關(guān)鍵因素， 飼料蛋白質(zhì)含量過高或過低均會影響魚類的生長和養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益[12]。因此，本實驗在李軍基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上設(shè)計NP-90比例為4%，NP-2002為5%，干飼料蛋白含量為73%，含水量為90.2%，接近血液水分含量，基本能滿足菲牛蛭的蛋白需求。

3.2 配合飼料和血液對菲牛蛭水蛭素活性的影響分析

水蛭素(Hirudin)是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的天然凝血酶特效抑制劑，是活血化淤的通經(jīng)良藥[13]。在菲牛蛭養(yǎng)殖中，水蛭素活性作為菲牛蛭養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)。在貴州養(yǎng)殖條件下，朱忠勝[14]得出幼體菲牛蛭水蛭素活性為73.24±3.65 U/g。本實驗中，水蛭活性血液組為76.1719±0.3906 U/g，配合飼料組為75.3906±0.3918 U/g，在統(tǒng)計學(xué)意義上，配合飼料組和血液組水蛭素活性無顯著差異(P>0.05)。表明在養(yǎng)殖周期為60 d，配合飼料對菲牛蛭水蛭素?zé)o影響。通過現(xiàn)場投喂觀察，攝食效果較好，配合飼料組菲牛蛭身體無“僵硬、起結(jié)”現(xiàn)象、有輕微的反吐，死亡量少，攝食效果優(yōu)于血液組。

3.3 菲牛蛭嗉囊和腸道中(SOD和CAT)與MDA活性表現(xiàn)形式相反

嗉囊(crop)是菲牛蛭消化系統(tǒng)中比較寬而長的部分(或稱胃)，內(nèi)胚層開始的位置，主要功能是儲藏食物。嗉囊的后端通過一幽門闊約肌開口于腸(intestine)，是一根適度寬闊的縱管，主要功能是消化吸收[15]。SOD和CAT是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶。SOD 作用于超氧陰離子自由基，使之轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)和氧氣((O2))，從而保護機體細胞免受損傷，是機體抗氧化能力的指示器[16]。而CAT 可以將SOD 的作用產(chǎn)物H2O2還原成水(H2O)，保護機體免受H2O2的毒性作用[17]。菲牛蛭嗉囊和腸道中SOD和CAT變現(xiàn)為同高同低現(xiàn)象，這與廖雅麗[18]研究鹽度對云紋石斑魚抗氧化酶和張楠[19]重金屬鋅對大型溞SOD、CAT酶活性影響結(jié)果相似。這可能與SOD作用于超氧陰離子自由基，產(chǎn)生過多的H2O2底物誘導(dǎo)CAT活性隨著上升。MDA 是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)(稱膜脂)過氧化作用形成的脂質(zhì)過氧化物，其含量的高低可以反映出機體脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映機體細胞受損傷程度[20]。機體中SOD和CAT處于較高水平時，清除過多的自由基，減少了自由基對生物膜脂質(zhì)的攻擊，導(dǎo)致MDA的含量減少。而本研究中，菲牛蛭腸道SOD和CAT活性較高，而MDA含量較低。嗉囊中SOD和CAT活性較低，而MDA含量較高。本實驗表明：菲牛蛭嗉囊和腸道SOD和CAT與MDA活性表現(xiàn)形式相反。

3.4 配合飼料和血液對菲牛蛭抗氧化指標(biāo)的影響分析

本實驗在張軍[8]基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上，調(diào)高了NP-2002和NP-2002的比例。NP-2002加工過程200℃噴霧干燥，93℃蒸發(fā)1～2 min；而NP-90是通過高速離心分離，250℃高溫滅菌而成，質(zhì)量性狀穩(wěn)定，不易變質(zhì)和滋生有害細菌。SOD 和CAT 是存在于生物體內(nèi)的非常重要的抗氧化防御性功能酶，在清除超氧自由基和氧化自由基，防止生物分子損傷方面發(fā)揮重要作用。而MDA是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷[21]，MDA含量的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映組織細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。研究表明：增加雜交鱘幼魚腸道[22]和中華絨鰲蟹[23]SOD和CAT 活力，并降低MDA含量，能提高魚體腸道的抗氧化能力。在菲牛蛭腸道組織中，配合飼料組SOD和CAT活性顯著高于血液組(P<0.05)，配合飼料組MDA含量也稍低于血液組。本實驗表明：該配方對菲牛蛭腸道抗氧化能力有一定的增強作用。

菲牛蛭嗉囊主要功能是儲存血液，消化吸收功能較弱。食物來源以吸食動物血液為主，并長期保存于嗉囊中，而動物血液離體后，質(zhì)量不穩(wěn)定，易污染、易腐敗和易滋生有害細菌。在不斷的進化過程中，菲牛蛭形成了自己獨特的消化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)[15]。李軍[8]實驗表明配合飼料飼養(yǎng)菲牛蛭成活率100%，血液組成活率為75%。這可能與血液的易質(zhì)性導(dǎo)致嗉囊組織細胞抗氧化損傷有關(guān)。本實驗中配合飼料組嗉囊中MDA含量和SOD活性顯著低于血液組(P<0.05)，CAT也稍低于血液組。本實驗結(jié)果表明：在菲牛蛭嗉囊組織中，配合飼料減少了SOD活力，但在MDA含量上配合飼料達到或超過血液飼養(yǎng)水平。

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