蔣海濤，王 紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義 563003)

結(jié)直腸癌(CRC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，由于飲食結(jié)構(gòu)與生活方式的改變，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，高居惡性腫瘤第3位[1-2]。目前研究認(rèn)為Notch信號(hào)通路及腫瘤干細(xì)胞(CSCs)在CRC的發(fā)生、發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。CSCs是一類具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞；CD133表達(dá)于多種腫瘤干細(xì)胞表面，是目前研究較為深入的CRC干細(xì)胞標(biāo)志物之一。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與CRC密切相關(guān)。研究表明在CRC中，Notch信號(hào)的異常表達(dá)可促使腫瘤干細(xì)胞發(fā)展為CRC，并且在促進(jìn)CRC干細(xì)胞的自我更新、分化、選擇性吸收及分泌過程也起到重要作用。目前關(guān)于Notch信號(hào)通路與CD133在CRC中的研究很少，本研究利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)50份CRC標(biāo)本中Notch3、DLL1、CD133的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床病理特征，旨在分析在CRC發(fā)生、發(fā)展的過程中上述指標(biāo)的可能作用機(jī)制，探討其與CRC浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院病理科2013-2015年手術(shù)切除后存檔的50份結(jié)直腸腺癌標(biāo)本，30例腺瘤標(biāo)本(腺瘤組)，并取12份正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本(正常組)。每份標(biāo)本臨床、病理資料完整，所有患者術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療，術(shù)后病理類型均經(jīng)病理診斷證實(shí)。結(jié)直腸腺癌標(biāo)本中，結(jié)腸腺癌30份，直腸腺癌20份，其來源患者中男25例，女25例，年齡26～77歲，中位年齡60歲，腫瘤直徑大于或等于5 cm 35例，<5 cm 15例；高分化腺癌13例，中分化腺癌32例，低分化腺癌5例；19例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，31例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Dukes分級(jí)，A/B期標(biāo)本28例，C/D期標(biāo)本22例；浸潤(rùn)深度為T1/T2期標(biāo)本8例，T3/T4期標(biāo)本42例。

1.2主要試劑 兔抗人多克隆抗體Notch3及DLL1購自美國(guó)Abcam公司，兔抗人CD133多克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海基因科技有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)法 所有蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，厚度約4 μm，經(jīng)二甲苯室溫下脫蠟、梯度乙醇水化、檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)等步驟后，使用免疫組織化學(xué)SP法染色，DAB顯色，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。所用抗體濃度分別為：兔抗人Notch3多克隆抗體(1∶400)，兔抗人DLL1多克隆抗體(1∶400)，兔抗人CD133多克隆抗體(1∶200)。已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷 按照WOLFF等[3]及楊軍等[4]推薦標(biāo)準(zhǔn)，首先在低倍鏡下(放大100倍)閱覽整張切片，察看目的細(xì)胞(腺癌/腺瘤/正常結(jié)直腸細(xì)胞)中陽性細(xì)胞的分布情況，摒除背景著色及非特異染色，選擇高表達(dá)區(qū)域高倍鏡下(放大400倍)進(jìn)一步觀察，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)所占同類型細(xì)胞的百分比，根據(jù)染色結(jié)果，將染色強(qiáng)度分為4級(jí)。陰性：即無著色；弱陽性：小于10%的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色；陽性：10%～30%的細(xì)胞出現(xiàn)深棕褐色的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色，或小于或等于70%的細(xì)胞出現(xiàn)弱/中等強(qiáng)度的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色；強(qiáng)陽性：大于30%的細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)棕褐色的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色，或大于70%的細(xì)胞呈中等強(qiáng)度細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜著色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Notch3、DLL1、CD133的表達(dá)情況 Notch3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組的陽性表達(dá)率分別為8.3%(1/12)、26.7%(8/30)、64.0%(32/50)，見圖1、表1。Notch3在腺癌組的陽性表達(dá)率顯著高于腺瘤組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在腺瘤組與正常組的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DLL1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組的陽性表達(dá)率分別為16.7%(2/12)、33.3%(10/30)、68.0%(34/50)，見圖2、表1。DLL1在腺癌組的陽性表達(dá)率顯著高腺瘤組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在腺瘤組與正常組的表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CD133蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，亦呈棕黃色顆粒；在正常組、腺瘤組、腺癌組陽性表達(dá)率分別為8.3%(1/12)、36.7%(11/30)、54.0%(27/50)，見圖3、表1。CD133在腺癌組的陽性表達(dá)率亦顯著高于腺瘤組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在腺瘤組及正常組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2Notch3、DLL1、CD133蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Notch3的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)；分別與Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Dukes分期越高陽性率越高。DLL1的表達(dá)與腫瘤Dukes分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，腫瘤的Dukes分期越高、浸潤(rùn)深度越深陽性率越高，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。CD133的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率顯著高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；而與年齡、分化程度等其他臨床病理資料無關(guān)(P>0.05)，見表2。

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖1 Notch在3組中的表達(dá)(×200)

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖2 DLL1在3組中的表達(dá)(×200)

A:正常組;B:腺瘤組;C:腺癌組

圖3 CD133在3組中的表達(dá)(×200)

2.3Notch3、DLL1、CD133表達(dá)的相關(guān)性 在Notch3蛋白陽性表達(dá)的32份結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本中，CD133蛋白的陽性表達(dá)率為85.2%(23/27)；在Notch3蛋白陰性表達(dá)的18份結(jié)直腸腺癌組織標(biāo)本中，CD133蛋白的陽性表達(dá)率為22.2%(4/18)；Spearman相關(guān)分析法統(tǒng)計(jì)分析顯示，在結(jié)直腸癌中Notch3與CD133表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.478，P=0.000)。Notch3與DLL1及DLL1與CD133表達(dá)均無明顯相關(guān)性，見表3。

表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

續(xù)表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

表3 Notch3與CD133蛋白在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

Notch信號(hào)通路和腫瘤干細(xì)胞是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。Notch信號(hào)通路主要由5種Notch配體、4種Notch受體及轉(zhuǎn)錄因子CSL構(gòu)成，5種Notch配體分別為DLL1、DLL3、DLL4以及Jagged1和Jagged2，4種Notch受體分別為Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。經(jīng)典的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化需經(jīng)歷3次裂解(S1、S2、S3)，產(chǎn)生Notch的活化片段NIC，NIC進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，共同形成轉(zhuǎn)錄活化復(fù)合體，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

Notch通路與多種實(shí)體腫瘤密切相關(guān)，大量研究表明，在CRC中Notch基因常出現(xiàn)異常表達(dá)。Notch3是Notch通路的受體之一，定位于19q12染色體；DLL1基因定位于6q27染色體，是Notch通路的配體之一。目前Notch3的研究主要集中在肺癌和卵巢癌，DLL1主要在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面研究較多，在CRC中的研究均較少。研究指出激活Notch3信號(hào)通路可促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移[5-6]，而miR-206通過下調(diào)Notch3基因的表達(dá)使腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移受到抑制[7]。本研究發(fā)現(xiàn)Notch3在正常結(jié)直腸黏膜組、腺瘤組、腺癌組中的表達(dá)呈逐漸遞增趨勢(shì)，表明高表達(dá)的Notch3與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且Notch3的表達(dá)與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Notch3與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。DLL1在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌中均高表達(dá)，在結(jié)腸癌中DLL1的陽性表達(dá)率約58%[8]；而本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中DLL1蛋白高表達(dá)，加用Notch信號(hào)通路阻斷劑DAPT作用于該細(xì)胞后，其陽性強(qiáng)度和陽性表達(dá)率均明顯下降[9]，進(jìn)一步證實(shí)了DLL1的表達(dá)與CRC密切相關(guān)。本試驗(yàn)中DLL1在正常組織、腺瘤、腺癌中表達(dá)率逐漸升高，在腺癌中陽性表達(dá)率達(dá)68.0%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符，結(jié)合臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，DLL1的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)，提示其可能參與了CRC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。對(duì)Notch3和DLL1的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)并無明顯相關(guān)性，提示在結(jié)直腸腺癌中Notch3和DLL1基因可能扮演致癌/促癌基因的角色，同時(shí)二者又互相獨(dú)立，并無相互作用。通過圖1及圖2可以發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)直腸腺管比較，結(jié)直腸腺癌的腺管明顯增粗，且細(xì)胞核排列紊亂、大小不一，提示Notch3和DLL1的高表達(dá)可能導(dǎo)致正常結(jié)直腸腺上皮過度增殖，并進(jìn)一步導(dǎo)致CRC的發(fā)生。此外結(jié)合患者臨床病理資料分析，Notch3和DLL1的異常表達(dá)可能與結(jié)直腸腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移存在著某種關(guān)系，將有望成為新的腫瘤標(biāo)記物推測(cè)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

腫瘤干細(xì)胞是目前研究的熱點(diǎn)，腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，CSCs是腫瘤組織中具有干細(xì)胞特性的一類細(xì)胞亞群，能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，不僅具有自我更新與無限增殖能力，還具有多向分化潛能，是惡性腫瘤的起源。CD133表達(dá)于多種腫瘤干細(xì)胞表面，是目前研究較為深入的結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物之一。與癌旁正常組織相比，CD133在CRC中的表達(dá)明顯升高[10]，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]，與本研究結(jié)果一致。HONG等[12]研究指出，CD133的表達(dá)與CRC患者臨床病理分期及預(yù)后均密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CD133在CRC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于腺瘤組及正常組，結(jié)合臨床病理資料進(jìn)一步分析，CD133在CRC中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明CD133蛋白表達(dá)陽性的患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

Notch通路與CSCs關(guān)系密切，Notch信號(hào)在維持CSCs特性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Notch信號(hào)通路激活后有利于CSCs的自我更新和存活，刺激CSCs增殖，最終形成腫瘤。在髓母細(xì)胞瘤中，阻斷Notch信號(hào)通路后，CD133表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量降低了5倍[13]。在CRC中，眾多腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物(如：CD133、CD44、LGR5、Hes1、MUSASHI-1等)的表達(dá)與Notch信號(hào)通路明顯相關(guān)[14-15]。APOSTOLOU等[16]發(fā)現(xiàn)Notch受體在結(jié)腸癌干細(xì)胞中高表達(dá)，敲除不同的Notch受體對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(Sox2，Oct4,Nanog)、CD44、Met原癌基因及二肽基肽酶-4均有不同程度的影響。本研究中，Notch3和CD133在CRC組織中均高表達(dá)，相關(guān)性分析顯示，二者在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.478，P=0.000)，提示Notch3和CD133基因之間也許存在某種關(guān)聯(lián)，Notch3信號(hào)通路是否通過對(duì)CSCs的調(diào)控而影響CRC的發(fā)生、發(fā)展，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，Notch3、DLL1、CD133的異常表達(dá)參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展過程，了解Notch3、DLL1、CD133蛋白的表達(dá)情況，對(duì)于評(píng)估CRC的發(fā)展及預(yù)后具有重要意義。Notch3與CD133的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，提示CRC的形成可能是由于Notch信號(hào)通路對(duì)CSCs的調(diào)控失調(diào)所致，進(jìn)一步深入研究對(duì)闡明CRC的發(fā)生機(jī)制及靶向治療具有重要意義。

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