部 璇,王建軍,白 靜,程愛(ài)斌

(河北理工大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北唐山 063000)

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion,IR)是腎移植后較為嚴(yán)重的不可避免的并發(fā)癥，對(duì)移植后的腎臟是否能夠存活起到重要作用。引起腎臟IR的機(jī)制較為復(fù)雜，已有研究顯示，活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成及炎癥介質(zhì)的釋放在腎臟IR中發(fā)揮重要作用[1-2]。增多的氧自由基可以進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)的損傷，包括DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化和硝基化、脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞凋亡等[3]。氫氣是一種惰性氣體，具有明確的抗氧化和清除自由基的作用。研究顯示，富氫溶液能夠有效減輕經(jīng)冷凍保存后進(jìn)行移植腎臟的IR損傷。但是，相應(yīng)的作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究利用小鼠模型，探討富氫鹽水(hydrogen-rich water,HRS)對(duì)小鼠腎臟IR損傷中氧化及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，闡明HRS減輕腎臟IR損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ICR小鼠80只，SPF級(jí)，體質(zhì)量25～30 g，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2儀器與試劑 生理鹽水購(gòu)自華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司；血生化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自成都斯瑪特科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；二辛可寧酸(Bicinchoninic,BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Bcl2，Bcl-xl,Bax，Bak,Cleaved Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司；β-actin、抗兔辣根過(guò)氧化物酶抗體、抗鼠辣根過(guò)氧化物酶抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。富氫水杯購(gòu)自廣州康旺電子科技有限公司；便攜式獸用生化檢測(cè)儀購(gòu)自普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司；可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.3方法

1.3.1HRS制備 向富氫水杯內(nèi)加入200 mL生理鹽水，按照廠家的操作步驟進(jìn)行HRS的制備，每次使用時(shí)制備新的HRS。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照(假手術(shù))組，IR組，IR+HRS組，每組6只小鼠。IR+HRS組小鼠于手術(shù)前3 d及再灌注前1 min尾靜脈注射0.2 mL HRS，再灌注后的2 h內(nèi)每隔0.5 h注射1次HRS。對(duì)照組和IR組小鼠尾靜脈注射相同體積的生理鹽水。小鼠用3.5%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，腹部備皮仰臥于手術(shù)臺(tái)上，對(duì)照組小鼠暴露腎臟并游離雙側(cè)腎蒂，但是不夾閉腎蒂。IR組和IR+HRS組用無(wú)損傷血管夾夾閉，45 min后松開(kāi)恢復(fù)腎臟血流，肉眼觀察腎臟顏色確認(rèn)腎臟再灌注是否成功，逐層關(guān)閉小鼠腹腔。

1.3.3血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)檢測(cè) IR后24 h摘小鼠眼球取血，3 000 r/min離心10 min后取上清液即為小鼠血清。取100 μL血清加入血生化檢測(cè)試劑盤(pán)內(nèi)，生化分析儀檢測(cè)SCr和BUN水平。

1.3.4腎組織SOD和MDA檢測(cè) IR后24 h獲取小鼠腎臟，稱(chēng)取1 g腎組織剪碎后放到玻璃勻漿器內(nèi)，按照組織質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶10的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，使用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后的組織懸液以3 000 r/min離心10 min后取上清液，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行SOD及MDA檢測(cè)。

1.3.5腎組織凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) IR后24 h獲取小鼠腎臟，稱(chēng)取1 g腎組織剪碎后放到玻璃勻漿器內(nèi)，加入預(yù)冷的含1%蛋白酶抑制劑的哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取液，研磨組織后冰上裂解1.5 h,以12 000 r/min離心10 min后取上清液即為蛋白提取物。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液后沸水煮蛋白8 min使蛋白變性。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為20 μg，電壓150 V,時(shí)間1.5 h。使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后使用5% BSA室溫封閉1 h，將膜放入兔抗Bcl2(1∶1 000)抗體,兔抗Bcl-xl(1∶1 000) 抗體,兔抗Bax(1∶1 000) 抗體,兔抗Bak(1∶1 000) 抗體,兔抗Cleaved Caspase-3(1∶1 000) 抗體,鼠抗β-actin(1∶10 000)抗體液中進(jìn)行孵育，孵育條件為4 ℃過(guò)夜。用TBST沖洗3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠和抗兔抗體，室溫孵育1 h后，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以目的蛋白的灰度值與β-actin蛋白的灰度值的比值代表相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1HRS處理降低小鼠血清SCr和BUN水平的影響 與對(duì)照組比較，IR后24 h小鼠血清SCr和BUN顯著升高，HRS處理后IR小鼠血清SCr和BUN明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HRS對(duì)小鼠血清SCr、BUN水平的影響

△:P<0.01，與對(duì)照組比較；*:P<0.01，與IR組比較

2.2HRS處理提高腎組織SOD酶活性同時(shí)降低MDA水平影響 與對(duì)照組比較，IR后24 h小鼠腎組織SOD酶活性顯著下降，MDA水平明顯增加，HRS預(yù)處理能夠提高IR小鼠腎組織SOD活性并降低腎組織內(nèi)的MDA水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HRS對(duì)小鼠腎臟SOD及MDA水平的影響

△：P<0.01，與對(duì)照組比較；*：P<0.01，與IR組比較

2.3HRS處理改變凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，I/R組抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xl在IR后24 h表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax,Bak,Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)，HRS預(yù)處理能夠上調(diào)IR后小鼠腎組織抗凋亡蛋白表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

##:P<0.01，與對(duì)照組比較；*:P<0.05，**:P<0.01，與IR組比較

圖1 HRS對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

2007年日本OHSAWA等[4]報(bào)道氫氣能夠通過(guò)選擇性清除羥自由基降低腦組織的IR，直接證實(shí)氫氣作為抗氧化劑具有治療作用[4]。隨后，關(guān)于氫氣治療組織IR的研究越來(lái)越多，研究顯示，吸入氫氣或飲用富氫水能夠減輕大鼠或小鼠大腦、肝臟、腎臟、卵巢、肌肉、小腸等組織器官的IR[3,4-9]。據(jù)報(bào)道，將待移植的大鼠腎臟放入預(yù)冷的富氫溶液中保存24～48 h后，移植腎臟的功能和移植受體存活率得到極大的提高，其作用機(jī)制主要是減少腎小管上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)和凋亡[1,8]，但是相關(guān)的信號(hào)通路變化并沒(méi)有得到深入研究。曾葵等[9]研究顯示，對(duì)大鼠IR模型在再灌注前10 min和再灌注后120 min持續(xù)進(jìn)行吸入氫氣處理，能夠有效減輕大鼠腎臟損傷，但是作用機(jī)制也沒(méi)有深入研究[9]。因此，本研究以小鼠腎臟IR模型為研究對(duì)象，觀察靜脈注射HRS對(duì)小鼠IR后腎臟功能、腎臟SOD、MDA水平以及凋亡相關(guān)的信號(hào)通路影響，闡明HRS減輕腎臟IR損傷的作用機(jī)制。

CUI等[5]研究顯示，靜脈注射HRS 1 min后，腎臟氫氣濃度達(dá)到峰值，因此本研究選擇在腎臟IR前1 min靜脈注射HRS，IR后的2 h內(nèi)每0.5小時(shí)注射1次HRS。結(jié)果顯示，HRS預(yù)處理能夠有效降低血清SCr和BUN水平，減輕腎功能損傷，這項(xiàng)結(jié)果與之前研究一致[9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中的中間產(chǎn)物，反映組織受氧自由基損傷的程度；SOD是體內(nèi)超氧自由基的清除因子，SOD水平的高低決定組織清除自由基的能力[10]。本結(jié)果顯示，HRS處理能夠有效減輕MDA的產(chǎn)生，提高SOD酶活性，進(jìn)而提高IR后腎組織抗氧化能力。

在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl2家族成員發(fā)揮著重要的作用。Bcl2家族可以分為兩大類(lèi)，一類(lèi)為抗凋亡蛋白包括Bcl2,Bcl-xl等蛋白，一類(lèi)為促凋亡蛋白包括Bak，Bax等蛋白。而Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，當(dāng)收到上游凋亡信號(hào)后，Caspase-3被活化變成Cleaved Caspase-3,啟動(dòng)凋亡的發(fā)生過(guò)程[11-12]。本研究結(jié)果顯示，腎臟IR后24 h Bcl2,Bcl-xl蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。HRS處理后能明顯上調(diào)Bcl2,Bcl-xl蛋白表達(dá)，下調(diào)Bak，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，靜脈注射HRS能夠減輕小鼠腎臟IR損傷，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低組織內(nèi)的ROS水平，增加組織抗氧化能力，并且通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2家族成員蛋白及Caspase-3蛋白降低腎臟組織細(xì)胞凋亡。氫氣作為一種無(wú)毒無(wú)害的具有抗氧化能力的氣體，在臨床上有巨大的應(yīng)用前景。關(guān)于氫氣對(duì)腎臟IR后炎癥細(xì)胞因子的影響在本研究中并沒(méi)有闡明，這項(xiàng)研究值得在以后的工作中深入開(kāi)展。

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