孫 云，馬國(guó)娟，胡曉杰，尹香云，彭彥輝

(河北省人民醫(yī)院：1.普外四科;2.門診部;3.普外三科,石家莊 050051)

研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia to mesenchymaltransition，EMT)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，它是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，在此過(guò)程中細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力明顯增強(qiáng)[1-2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(the transforming growth factor-β1,TGF-β1)是EMT的重要誘導(dǎo)因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用。研究顯示，進(jìn)展期胃癌患者TGF-β1表達(dá)升高，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞EMT進(jìn)程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[3]。但是，胃癌中TGF-β1調(diào)控EMT的分子機(jī)制尚不清楚。LMO1是由2個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域組成的輔助轉(zhuǎn)錄因子，其LIM結(jié)構(gòu)域可作為蛋白質(zhì)相互作用的適配器，通過(guò)與其他蛋白相互作用形成復(fù)合體，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞分化、增殖等生物學(xué)過(guò)程[4]。研究顯示，LMO1在T淋巴細(xì)胞白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌患者中表達(dá)升高，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示LMO1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。有研究顯示LMO家族其他成員LMO2、LMO4參與了EMT的調(diào)控[6]。然而，LMO1是否參與TGF-β1介導(dǎo)的EMT進(jìn)程目前尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)Real time-PCR和Western blot等技術(shù)探討LMO1在TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌MKN28細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移中的作用，為闡明胃癌發(fā)病機(jī)制及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑 人胃癌MKN28細(xì)胞購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、LMO1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endoth elial growth factor,VEGF)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；胎牛血清、PRMI 1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000、TGF-β1、Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；LMO1 siRNA及陰性對(duì)照siRNA 由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；Transwell小室、Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，2 d換液1次。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分4組：對(duì)照組(5% BSA)、TGF-β1誘導(dǎo)組(10 μg/L)、陰性轉(zhuǎn)染組(TGF-β1+陰性轉(zhuǎn)染siRNA)、LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組(TGF-β1+LMO1-siRNA)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)Gene Bank中人LMO1基因序列設(shè)計(jì)特異性siRNA。LMO1-siRNA序列為：正義：5′-GGG CCC GAG ACA ATG TGT AT-3′，反義：5′-AGA CGG ACA GAT GGA CCT GG-3′;同時(shí)合成一條熒光素標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN28細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Real time-PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá) 根據(jù)Gene Bank中人LMO1 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Trizol提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。在ABI 7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后采用儀器自帶的SDS v1.3軟件分析得出各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值。設(shè)對(duì)照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，目的基因表達(dá)水平的相對(duì)定量值RQ=2-ΔΔCt，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析，以GAPDH為內(nèi)參照基因。

表1 LMO1、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH引物序列

1.2.4Western blot檢測(cè)目的基因蛋白質(zhì) 細(xì)胞加入裂解液100 μL，冰上靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將50 μg總蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性E-cadherin、N-cadherin、LMO1、MMP-9、VEGF抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件檢測(cè)并分析蛋白條帶IOD值，以GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行定量分析。

1.2.5Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力 將Matrigel膠用PRMI 1640培養(yǎng)基稀釋后均勻涂于8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的Transwell小室上室。收集轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組MKN28細(xì)胞，用不含血清的PRMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL)，取200 μL單細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI 1640培養(yǎng)基800 μL。培養(yǎng)24 h后取出Transuell小室，用棉簽擦拭掉小室底部未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(×200)計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，求均值。

表2 TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、LMO1表達(dá)的影響

*：P<0.01,與對(duì)照組比較;▲：P<0.01，與TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組比較

1.2.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 Transwell小室不涂抹Matrigel膠，其余步驟同1.2.5。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組細(xì)胞仍表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈鵝卵石樣，且細(xì)胞間連接緊密。TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞由緊密連接的多角形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或紡錘體形，細(xì)胞多分散，呈典型的EMT形態(tài)改變。LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組部分細(xì)胞恢復(fù)成梭形，細(xì)胞間連接略疏松，即LMO1-siRNA特異性下調(diào)LMO1能夠明顯減弱TGF-β1誘導(dǎo)MKN28細(xì)胞引起的EMT形態(tài)改變。

A:對(duì)照組；B:TGF-β1誘導(dǎo)組；C:陰性轉(zhuǎn)染組；D:LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組

圖1 Western blot檢測(cè)各組E-cadherin、N-cadherin、LMO1表達(dá)情況

2.2TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物及LMO1表達(dá)的影響 Real time-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)顯著下降，N-cadherin、LMO1表達(dá)顯著上升(P<0.01)，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組E-cadherin表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組顯著回升，N-cadherin、LMO1表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組顯著降低(P<0.01)，但和對(duì)照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2，圖1。

2.3TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)各組胃癌MKN28細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(312±22)個(gè)和(318±26)個(gè)，較對(duì)照組[(116±18)個(gè)]顯著增加(P<0.01)，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)[(197±20)個(gè)]顯著降低(P<0.01)，但與對(duì)照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

A:對(duì)照組；B:TGF-β1誘導(dǎo)組；C:陰性轉(zhuǎn)染組；D:LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組

圖2 TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)各組胃癌MKN28細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)各組胃癌MKN28細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(458±28)個(gè)和(470±26)個(gè)，較對(duì)照組[(231±22)個(gè)]顯著增加(P<0.01)，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)[(301±27)個(gè)]顯著降低(P<0.01)，但與對(duì)照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

A:對(duì)照組；B:TGF-β1誘導(dǎo)組；C:陰性轉(zhuǎn)染組；D:LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組

圖3 TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)各組胃癌MKN28細(xì)胞遷移能力的影響

2.5TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組MMP-9、VEGF表達(dá)顯著上升(P<0.01)，TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組MMP-9、VEGF表達(dá)較TGF-β1誘導(dǎo)組和陰性轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.01)，但和對(duì)照組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖4。

表3 TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)胃癌MKN28細(xì)胞MMP-9、VEGF表達(dá)的影響

*：P<0.01,與對(duì)照組比較;▲：P<0.01，與TGF-β1誘導(dǎo)組、陰性轉(zhuǎn)染組比較

A:對(duì)照組；B:TGF-β1誘導(dǎo)組；C:陰性轉(zhuǎn)染組；D:LMO1-siRNA轉(zhuǎn)染組

圖4 Western blot檢測(cè)各組MMP-9、VEGF表達(dá)情況

3 討 論

胃癌是來(lái)源于胃黏膜上皮的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率極高，居惡性腫瘤的第2位[7]。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年約有60%的胃癌患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]。因此，尋找與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶向分子，對(duì)于深入探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并探索積極有效的治療措施、改善患者預(yù)后具有重要意義。

TGF-β1是TGF家族的重要成員，具有多種生物學(xué)功能，已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。TGF-β1可通過(guò)Smad依賴性和非Smad依賴性途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程。LMO1是LMO家族成員，主要通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性參與細(xì)胞分化、增殖等生物學(xué)過(guò)程[4]。研究顯示，LMO1與T淋巴細(xì)胞白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?；颊週MO1表達(dá)升高，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示LMO1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)人胃癌MKN28細(xì)胞后出現(xiàn)典型的EMT形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞由緊密連接的多角形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或紡錘體形，細(xì)胞多分散。Real time-PCR和Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后MKN28細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明TGF-β1是EMT的有效誘導(dǎo)因子，與HELDIN等[11]的報(bào)道一致。同時(shí)在TGF-β1誘導(dǎo)MKN28細(xì)胞出現(xiàn)的EMT進(jìn)程中，LMO1表達(dá)顯著上調(diào)。SAEKI等[12]研究顯示，TGF-β1通過(guò)上調(diào)LMO1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，與本研究結(jié)果一致。本研究采用Tanswell小室實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)后MKN28細(xì)胞侵襲遷移能力及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-9、VEGF)表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后MKN28細(xì)胞侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)，MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明TGF-β1誘導(dǎo)后MKN28細(xì)胞經(jīng)歷了EMT進(jìn)程。為進(jìn)一步闡明LMO1在TGF-β1調(diào)控MKN28細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)移的作用，筆者采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)LMO1表達(dá)，結(jié)果顯示，下調(diào)LMO1表達(dá)能夠明顯逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的MKN28細(xì)胞出現(xiàn)EMT形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)E-cadherin表達(dá)顯著回升，N-cadherin、MMP-9、VEGF表達(dá)顯著下降。以上結(jié)果充分證實(shí)LMO1在TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可能發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1可能通過(guò)某種信號(hào)通路上調(diào)其靶基因LMO1表達(dá)，從而明顯增強(qiáng)胃癌MKN28細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這可能是TGF-β1誘導(dǎo)MKN28細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。本研究為深入探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及尋找治療胃癌的分子靶點(diǎn)提供了新思路。然而，TGF-β1調(diào)控LMO1表達(dá)的具體分子機(jī)制尚待后續(xù)研究。

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