陳小瑩，李欣然，王清，付霞霏

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510282)

干細(xì)胞是一類能自我增殖、具有多向分化潛能的細(xì)胞，由于其臨床應(yīng)用的可行性及其生物學(xué)的重要特性，干細(xì)胞治療成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有取材容易、可自身移植避免免疫排斥等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于組織工程和細(xì)胞治療的研究中[2]。而在深入進(jìn)行細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對移植的 MSCs 進(jìn)行標(biāo)記以起到體內(nèi)示蹤的作用。本試驗(yàn)采用細(xì)胞膜熒光染料氯苯甲酰氨-1，1′雙十八烷基-3，3′，3′，3′-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(CM-Dil)標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，觀察其標(biāo)記情況，為進(jìn)一步利用MSCs進(jìn)行移植研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 4周齡近交系SPF級Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量80 g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK(粵)2011-0074]。

1.2材料 Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其完全培養(yǎng)基購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司、 PBS 緩沖液購自Hyclone公司、胰蛋白酶購自 Gibco 公 司、 CM-Dil標(biāo)記液購自Thermo Fisher Scientific公司、細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8(CCK8)試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.3方法

1.3.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，用剪刀從中間剪斷股骨及脛骨，用5 mL注射器抽取適量含 10%胎牛血清的專用培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將所得細(xì)胞懸液直接接種于T-25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度約為1×109/L。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h后半量更換完全培養(yǎng)基。以后每2～3天全量更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合約80%時可進(jìn)行1∶2傳代，用0.25%胰酶消化，以5×104/cm2細(xì)胞濃度傳代擴(kuò)增。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，取第3代細(xì)胞用于以下試驗(yàn)。

1.3.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 將貼壁細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD29、CD45、CD44。

1.3.3CM-Dil標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 試驗(yàn)分4組：MSC組、標(biāo)記組1(1 μg/mL)、標(biāo)記組2(2 μg/mL)、標(biāo)記組3(4 μg/mL)。將細(xì)胞消化制成細(xì)胞濃度約為1×106/mL的細(xì)胞懸液，標(biāo)記組1～3分別加入適量1 mg/L的 CM-Dil存儲液，使其最終濃度分別達(dá)1、2、4 μg/mL，隨后置于培養(yǎng)箱37 ℃下孵育30 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，PBS沖洗2遍，用完全培養(yǎng)基重懸接種于培養(yǎng)瓶。

1.3.4CM-Dil標(biāo)記率的觀察 標(biāo)記完成后15 min繼續(xù)孵育24、48、72 h在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的CM-Dil陽性標(biāo)記率，陽性標(biāo)記率為隨機(jī)取10個非重疊視野(×100)，計(jì)算CM-Dil陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。細(xì)胞融合約80%時消化傳代培養(yǎng)，每次傳代后觀察細(xì)胞形態(tài)及標(biāo)記率。

1.3.5CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞增殖能力檢測 細(xì)胞標(biāo)記后直接以細(xì)胞濃度為1×104/mL接種于96孔板中，每組 35 孔細(xì)胞，每孔體積100 μL。每天08:00每組各取5孔細(xì)胞，加入 10 μL CCK8 孵育4 h后，用全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度(OD)值，連續(xù)7 d，并繪制生長曲線。

1.3.6CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞標(biāo)記后48 h制備成細(xì)胞懸液，利用PI-流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，剛分離接種時細(xì)胞為圓形、橢圓形，接種24 h后在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),開始有少部分細(xì)胞貼附于瓶底。72 h后絕大部分細(xì)胞貼壁,呈梭形或多角形,呈集落樣生長。培養(yǎng)5～7 d后,細(xì)胞達(dá)80%融合,可進(jìn)行細(xì)胞的首次傳代。傳代后細(xì)胞較原代略大，經(jīng)4～5 d即可達(dá)80%融合。經(jīng)傳3～4代后,細(xì)胞為長梭形,形態(tài)均一,排列有序(圖1)。

A：原代MSCs第3天(×100)；B：第3代MSCs(×100)

圖1原代及第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2.2MSCs鑒定 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，90%以上細(xì)胞CD34和CD45表達(dá)陰性,CD44和CD29表達(dá)陽性。

2.3CM-Dil標(biāo)記后細(xì)胞熒光表達(dá)情況及形態(tài)變化 CM-Dil濃度為1、2、4 μg/mL標(biāo)記后15 min即見到紅色熒光(圖2)，標(biāo)記率分別為(31.60±1.25)%、(88.73±1.79)%、(96.89±1.31)%。4 μg/mL組標(biāo)記率明顯高于其他兩組，經(jīng)ANOVA分析，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 757.21，P=0.000)。采用SNK法進(jìn)行兩組間比較，1 μg/mL組與2、4 μg/mL組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2 μg/mL組與4 μg/mL組比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而各組染色后24、48、72 h的細(xì)胞標(biāo)記率進(jìn)行組內(nèi)比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞標(biāo)記后傳代至第6代時熒光表達(dá)仍較強(qiáng)，之后熒光強(qiáng)度開始衰減。標(biāo)記的細(xì)胞在綠色熒光激發(fā)下呈現(xiàn)紅色熒光,且細(xì)胞形狀同未染色細(xì)胞大致相同。

A：懸浮MSC 4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記15 min(白光×100)； B：懸浮MSC 4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記15 min(熒光×100)；C：懸浮狀態(tài)4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記MSC第3代(白光×200)；D：懸浮狀態(tài)4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記MSC第3代(熒光×200)；E：貼壁4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記MSC第6代(熒光×100)；F：貼壁4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記MSC第8代(熒光×200)

圖2 MSC用CM-Dil標(biāo)記后的熒光表達(dá)情況

2.4標(biāo)記細(xì)胞增殖能力的檢測 4組MSCs的生長曲線如圖3所示。細(xì)胞增殖能力的檢測結(jié)果表明不同標(biāo)記濃度組與未標(biāo)記組的細(xì)胞生長趨勢相似，表明CM-Dil標(biāo)記后 MSCs的增殖不受影響。

圖3 4組MSCs的生長曲線

2.5標(biāo)記細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測 由表1可見，4組間細(xì)胞周期G1期、S期及G2/M期百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.665，P=0.251；F=1.317，P=0.335；F=2.159，P=0.171)，表明標(biāo)記后細(xì)胞周期并沒有改變，無細(xì)胞增殖阻滯，提示CM-Dil對MSCs無細(xì)胞毒性。

表1 4組細(xì)胞細(xì)胞周期比較%)

*:P>0.05,與MSC組比較

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞，具有多向分化的潛能，在特定環(huán)境下可分化為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，其應(yīng)用前景不可估量。目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法主要有：全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心分離法等[3-4]。本試驗(yàn)采用全骨髓貼壁分離法成功分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。全骨髓貼壁法不僅根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁性來去除雜質(zhì)細(xì)胞,而且還通過不同細(xì)胞所需的消化時間不同來達(dá)到純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的[5]。利用造血系細(xì)胞懸浮生長，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性，每次換液去除造血系細(xì)胞；再根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較成纖維細(xì)胞易脫落的特點(diǎn)，傳代時嚴(yán)格掌握消化酶的量和消化時間，待細(xì)胞稍見回縮即終止消化，這樣不僅能使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到進(jìn)一步純化，還能保持細(xì)胞的活性。經(jīng)數(shù)次傳代，可獲得平行狀或輻射狀的形態(tài)均一的梭形骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定證實(shí)全骨髓貼壁法獲得的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純化程度高，且增殖能力活躍，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性。

細(xì)胞標(biāo)記在干細(xì)胞移植及分化研究中是必不可少的環(huán)節(jié)。這就需要一種盡可能操作簡便、技術(shù)可靠、結(jié)果可信、便于檢測的細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)。至今為止已有多種細(xì)胞標(biāo)記示蹤方法，包括綠色熒光蛋白、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、細(xì)胞膜或核染料等[6-8]，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。綠色熒光蛋白標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng)，是目前被較為廣泛接受的標(biāo)記方法，但其標(biāo)記程序復(fù)雜繁瑣，而且延長組織固定時間熒光信號會受影響[9]；4,6-聯(lián)咪-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記時間短，且標(biāo)記后細(xì)胞停止增殖，不適合體內(nèi)試驗(yàn)[10]；而5-溴脫氧尿嘧啶核苷的移植細(xì)胞死亡后，其中的BrdU將會釋放出來，并被鄰近細(xì)胞攝取而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性[11]。

CM-Dil是一種親脂性羰花青熒光膜染料，是目前較好的熒光染料。目前可用的親脂性羰花青，包括Dil和Dio，PKH2及PKH26染料，在標(biāo)記懸浮細(xì)胞過程中有時需要滲透壓調(diào)節(jié)劑或去鹽來避免在標(biāo)記過程中形成染料沉淀。此外，Dil標(biāo)記不能在常規(guī)組織固定過程中兼容而進(jìn)行長期保存。與Dil不同，CM-Dil的CM基團(tuán)能與多肽及蛋白上的巰基反應(yīng)從而使該分子在醛類物質(zhì)中保持穩(wěn)定，因此標(biāo)記后進(jìn)行固定、脫水及石蠟包埋等操作并不影響其熒光效果。CM-Dil可在綠色熒光激發(fā)下，發(fā)射出波長為570 nm的紅色熒光。本研究對CM-Dil標(biāo)記后細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡下形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)無明顯異常。另外，CM-Dil標(biāo)記后細(xì)胞生長曲線的分析說明CM-Dil標(biāo)記后細(xì)胞的增殖不受影響，而且細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明細(xì)胞標(biāo)記后無細(xì)胞阻滯。研究結(jié)果提示低濃度CM-Dil對細(xì)胞沒有毒性作用，與馬慧雨等[12]的研究結(jié)果一致。此外，張雅妮等[13]的研究還顯示，CM-Dil標(biāo)記后對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力并無明顯影響。本試驗(yàn)通過比較不同濃度CM-Dil對MSCs的標(biāo)記率，發(fā)現(xiàn)4 μg/mL CM-Dil濃度具有較高的標(biāo)記率，標(biāo)記率可達(dá)96%以上。標(biāo)記后15 min在熒光顯微鏡下即可看到很強(qiáng)的熒光表達(dá)。傳至第6代時熒光表達(dá)仍較強(qiáng)，之后熒光強(qiáng)度開始減弱。熒光強(qiáng)度衰減可能與操作過程中未能完全避光、細(xì)胞分裂膜染料減少等有關(guān)。

綜上所述，本試驗(yàn)通過全骨髓貼壁法獲得較高純度、生物學(xué)特征穩(wěn)定的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法簡單，成功率高，可作為分離、培養(yǎng)人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可借鑒方法之一，為日后臨床應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。利用4 μg/mL CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞，標(biāo)記率高，方法簡單可靠，熒光淬滅時間較長，檢測方法簡便，可直接在熒光顯微鏡下觀察。CM-Dil標(biāo)記作為一種高效穩(wěn)定、用于一定時期內(nèi)追蹤間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記方法，可用于追蹤間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)移植后能否在靶器官定植及分化，在組織工程中有較好的應(yīng)用前景。

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