李明華,孟秀梅,2

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 淮安 223003；2.江蘇食品加工工程技術(shù)研究開發(fā)中心,江蘇 淮安 223003)

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)又被稱為β-苯乳酸或3-苯基乳酸,是一種安全、高效的生物防腐劑,能夠廣泛抑制食品中致病性及腐敗性微生物的生長(zhǎng)繁殖［1］。與其他生物防腐劑相比,苯乳酸還具有諸多優(yōu)點(diǎn),如易溶、易在食品中擴(kuò)散、對(duì)酸和熱穩(wěn)定性高等［2］,可廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)中。

目前,已發(fā)現(xiàn)多個(gè)種屬的微生物可合成苯乳酸,如白地霉［3］、丙酸菌［4］、片球菌［5-6］、芽孢桿菌［7］和乳酸菌等［8］。其中,作為重要的益生菌,乳酸菌應(yīng)用歷史悠久且安全性高,已成為合成苯乳酸的研究熱點(diǎn)。近年來(lái),已有多名學(xué)者應(yīng)用干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)［9］、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)［10］和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)［11-12］等乳酸菌菌株發(fā)酵合成苯乳酸,產(chǎn)量多在2.0 g/L以下。在微生物發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵液成分復(fù)雜,產(chǎn)物后期提取困難,且高濃度的底物和產(chǎn)物都可抑制菌體生長(zhǎng),最終影響到苯乳酸產(chǎn)量。而靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是在反應(yīng)體系中,以微生物細(xì)胞作為催化劑,將外源底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的一種轉(zhuǎn)化方法。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中,菌體不再生長(zhǎng)繁殖,反應(yīng)體系副產(chǎn)物少,產(chǎn)物易分離純化,且反應(yīng)專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)時(shí)間短,反應(yīng)條件更易控制［13］。本研究嘗試應(yīng)用植物乳桿菌靜息細(xì)胞作為催化劑,轉(zhuǎn)化苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)合成苯乳酸,并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RF-16：分離自泡菜中［14］,于本實(shí)驗(yàn)室保存；苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯丙酮酸(分析純),三氟乙酸(色譜純)：上海阿拉丁試劑公司；甲醇(色譜純)：德國(guó)默克公司；其他主要化學(xué)試劑為市售分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母膏5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,NaAc·3H2O 5.0 g/L,K2HPO42.0 g/L,檸檬酸三銨2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,吐溫-80 1 mL,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,pH 6.2～6.4。在以上液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉即為MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZD-85A恒溫振蕩器：金壇科析儀器有限公司；TGL-20C高速冷凍離心機(jī)：上海新拓公司；LC-20AB液相色譜儀：日本島津公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將-20℃冰箱內(nèi)保存的植物乳桿菌菌種劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落,相同條件下轉(zhuǎn)接一次,然后挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)20 h備用。

1.3.2 靜息細(xì)胞制備

將活化的菌種按體積分?jǐn)?shù)1%的比例接種于含200 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)16 h,然后于4℃、8 000 r/min條件下離心10 min,菌體用50 mmol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer saline,PBS)洗滌兩遍,即制得植物乳桿菌靜息細(xì)胞。

1.3.3 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法

在100 mL三角瓶中,將緩沖液、苯丙酮酸和靜息細(xì)胞按一定比例配制成15 mL反應(yīng)液,密封后置于恒溫振蕩器中120r/min條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng),反應(yīng)一定時(shí)間后取樣,測(cè)定上清液中苯乳酸含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在15 mL反應(yīng)體系中,分別在不同轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH、靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度、苯丙酮酸質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度的條件下,反應(yīng)一定時(shí)間后,取樣測(cè)定苯乳酸含量,確定不同因素對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度、苯丙酮酸質(zhì)量濃度、葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間為考察因素,以苯乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn),因素與水平如表1所示。

表1 苯乳酸轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for transformation conditions optimization of phenyllactic acid

1.3.6 苯乳酸含量測(cè)定方法

按照參考文獻(xiàn)［15］,流動(dòng)相A、B分別為0.05%的三氟乙酸甲醇溶液和0.05%的三氟乙酸水溶液。樣品按如下程序洗脫：0～20 min,流動(dòng)相A 10%～100%,20～23 min保持100%；24～25 min,流動(dòng)相A 100%～10%。流動(dòng)相流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,柱溫30℃,樣品上樣量10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

2.1.1 不同菌齡對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化在本質(zhì)上為酶催化的生化反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)酶的含量和活性直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量。因菌體在不同生長(zhǎng)階段相應(yīng)酶的表達(dá)水平差別較大,因此首先要確定不同菌齡細(xì)胞的催化活性。在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度100g/L、底物質(zhì)量濃度4.0 g/L、pH6.5的反應(yīng)體系中,于120 r/min、35℃的條件下?lián)u床轉(zhuǎn)化6 h,苯乳酸產(chǎn)量如圖1所示。

圖1 菌齡對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of bacterial age on phenyllactic acid yield

由圖1可知,在菌體培養(yǎng)至15～20 h時(shí),苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到最高,說(shuō)明該段菌齡細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性最大,考慮到菌株RF-16在培養(yǎng)至16 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期［14］,細(xì)胞得率最高,因此后續(xù)試驗(yàn)均采用菌齡為16h的靜息細(xì)胞進(jìn)行催化。

2.1.2 靜息細(xì)胞濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖2 靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of cell concentration on phenyllactic acid yield

在酶催化反應(yīng)中,產(chǎn)物產(chǎn)量除了與酶活性相關(guān)外,與酶的濃度也有直接關(guān)系。在靜息細(xì)胞反應(yīng)體系內(nèi),細(xì)胞濃度決定了酶的濃度。由圖2可知,隨著靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度的提高,苯乳酸產(chǎn)量也隨之增加,在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí),苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到最高,為1.31 g/L。但靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度＞100 g/L時(shí),可能由于傳質(zhì)限制,影響了酶的催化反應(yīng),致使苯乳酸產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此選擇靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度60 g/L、80 g/L、100 g/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 苯丙酮酸濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L,pH為6.5,底物質(zhì)量濃度分別為1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L的反應(yīng)體系中,35℃轉(zhuǎn)化6 h,苯乳酸的產(chǎn)量如圖3所示。

圖3 苯丙酮酸質(zhì)量濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of PPA concentration on phenyllactic acid yield

由圖3可知,隨著苯丙酮酸質(zhì)量濃度的提高,苯乳酸產(chǎn)量隨之提高,但苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞2.0 g/L后,苯乳酸產(chǎn)量增加緩慢；苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞4.0 g/L后,苯乳酸產(chǎn)量逐漸降低,可能是底物抑制了轉(zhuǎn)化反應(yīng)所致。因此選擇苯丙酮酸質(zhì)量濃度2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖4 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on phenyllactic acid yield

在植物乳桿菌細(xì)胞內(nèi),催化苯丙酮酸合成苯乳酸的酶為NADH依賴性乳酸脫氫酶［16］,NADH的供應(yīng)將直接影響苯乳酸的產(chǎn)量。為提供充足的NADH,除了直接在反應(yīng)體系中添加或在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建輔酶再生體系外［17］,還可通過(guò)在靜息細(xì)胞反應(yīng)體系中添加輔助底物的方式構(gòu)建與細(xì)胞自身代謝過(guò)程藕合的輔酶再生系統(tǒng),其中葡萄糖即為常用的輔助底物之一［18-19］。在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L,pH為6.5,苯丙酮酸質(zhì)量濃度為3.0 g/L的反應(yīng)體系中分別添加不同濃度的葡萄糖,35℃轉(zhuǎn)化6 h,苯乳酸產(chǎn)量如圖4所示。由圖4可知,葡萄糖的添加顯著提高了苯乳酸的產(chǎn)量,在質(zhì)量濃度為8.0 g/L時(shí),產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到1.63 g/L,比未添加葡萄糖的反應(yīng)體系提高了23.48%。但是,質(zhì)量濃度超過(guò)12.0g/L后,可能葡萄糖經(jīng)過(guò)代謝后改變了反應(yīng)體系的pH,從而導(dǎo)致了苯乳酸產(chǎn)量下降。因此選擇葡萄糖質(zhì)量濃度4.0g/L、8.0g/L、12.0 g/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.5 轉(zhuǎn)化pH對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L的反應(yīng)體系中,改變緩沖液的pH,35℃搖床內(nèi)轉(zhuǎn)化6 h,考察pH對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響。由圖5可以看出,轉(zhuǎn)化pH對(duì)細(xì)胞催化反應(yīng)有嚴(yán)重影響,pH≤5.5或≥7.5時(shí),苯乳酸產(chǎn)量較低；而pH為6.0～7.0時(shí),苯乳酸的產(chǎn)量較高,其中pH6.5時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高,為1.56 g/L,說(shuō)明乳酸脫氫酶在該pH范圍內(nèi)催化活性較高。

圖5 轉(zhuǎn)化pH對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of conversion pH on phenyllactic acid yield

2.1.6 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖6 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of conversion temperature on phenyllactic acid yield

在生物催化過(guò)程中,溫度一方面影響酶的催化活性,另一方面也可影響酶的穩(wěn)定性。為考察溫度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響,在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80 g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L,pH為6.5的反應(yīng)體系中,分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高,苯乳酸產(chǎn)量也隨之提高,在轉(zhuǎn)化溫度為35℃時(shí),苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到最高,為1.61 g/L；繼續(xù)提高反應(yīng)溫度,苯乳酸產(chǎn)量逐漸降低,可能是因?yàn)楦邷赜绊懥嗣傅幕钚曰蚍€(wěn)定性。

2.1.7 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

在靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為80g/L,苯丙酮酸和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為3.0 g/L和8.0 g/L,pH為6.5的反應(yīng)體系中,35℃條件下轉(zhuǎn)化不同時(shí)間,比較苯乳酸產(chǎn)量,結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,在轉(zhuǎn)化開始的2 h內(nèi),苯乳酸產(chǎn)量快速上升,轉(zhuǎn)化至2 h時(shí),產(chǎn)量為1.31 g/L；隨后,苯乳酸產(chǎn)量緩慢上升,轉(zhuǎn)化至4 h時(shí),基本達(dá)到穩(wěn)定,為1.63 g/L,進(jìn)一步延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間,苯乳酸產(chǎn)量沒有明顯變化,可能因?yàn)楫a(chǎn)物的反饋抑制作用或反應(yīng)體系pH的變化影響了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行,導(dǎo)致苯乳酸產(chǎn)量未進(jìn)一步的提高。因此,在該反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下,反應(yīng)進(jìn)行4 h后即可停止反應(yīng)。因此選擇轉(zhuǎn)化時(shí)間3 h、4 h、5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖7 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of conversion time on PLA yield

2.2 苯乳酸轉(zhuǎn)化的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在前人進(jìn)行的苯乳酸生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化試驗(yàn)中,優(yōu)化后的最佳轉(zhuǎn)化pH和溫度往往和單因素試驗(yàn)最佳值一致［12,20］,因此在本研究中,僅以靜息細(xì)胞濃度、苯丙酮酸濃度、葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間為試驗(yàn)因子,以苯乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表2和表3。

由正交試驗(yàn)分析結(jié)果可得,在4個(gè)影響苯乳酸產(chǎn)量的因素中,影響大小的順序?yàn)锳＞D＞B＞C,即靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度＞轉(zhuǎn)化時(shí)間＞苯丙酮酸質(zhì)量濃度＞葡萄糖質(zhì)量濃度；各因素最佳優(yōu)化條件為A2B2C1D2,即靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度為8.0 g/L,苯丙酮酸質(zhì)量濃度為3.0 g/L,葡萄糖質(zhì)量濃度為4.0g/L,轉(zhuǎn)化時(shí)間為4 h。表3方差分析結(jié)果表明,靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)苯乳酸產(chǎn)量影響顯著(P＜0.05),而其他3因素影響不顯著。將以上正交試驗(yàn)優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果表明,苯乳酸平均產(chǎn)量為1.68 g/L,優(yōu)于正交試驗(yàn)中的所有組合,說(shuō)明此工藝條件合理,試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

表2 苯乳酸轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for phenyllactic acid conversion conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 細(xì)胞重復(fù)利用次數(shù)對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

圖8 重復(fù)次數(shù)對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of repetition times on phenyllactic acid yield

將反應(yīng)4 h后的靜息細(xì)胞4℃、8 000 r/min離心10 min后收集,在同樣的反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng),考察重復(fù)使用后細(xì)胞的催化活性,結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明,在靜息細(xì)胞催化過(guò)程中,第1～4批次細(xì)胞催化活性相對(duì)穩(wěn)定,苯乳酸產(chǎn)量分別為1.65g/L、1.56g/L、1.32g/L和1.35g/L,但在第5次催化中,苯乳酸產(chǎn)量顯著下降,為0.89 g/L,僅為初次反應(yīng)的53.94%,這可能因?yàn)榻?jīng)過(guò)多次操作后造成部分酶的失活,或輔酶NADH的再生無(wú)法滿足細(xì)胞催化反應(yīng)所致。

3 結(jié)論

本研究采用植物乳桿菌靜息細(xì)胞作為催化劑,以苯丙酮酸為底物合成苯乳酸。經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn),獲得了合成苯乳酸的最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度35℃、pH 6.5、靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度80 g/L、苯丙酮酸質(zhì)量濃度3.0 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度4.0 g/L、轉(zhuǎn)化時(shí)間4.0 h,在該條件下,苯乳酸產(chǎn)量為1.68 g/L,且細(xì)胞經(jīng)過(guò)4次重復(fù)利用,苯乳酸產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定。此外,在本研究中,葡萄糖作為輔助底物,可在一定程度上提高輔酶NADH的再生能力［13］,從而顯著提高了苯乳酸的產(chǎn)量。

參考文獻(xiàn)：

［1］DIEULEVEUX V,LEMARINIERS,GUEGUEN M.Antimicrobial spectrum and target site of D-3-phenyllactic acid［J］.Int J Food Microbiol,1998,40(3)：177-183.

［2］SCHNüRERJ,MAGNUSSON J.Antifungal lactic acid bacteria asbiopreservatives［J］.Trend Food Sci Technol,2005,16(1)：70-78.

［3］DIEULEVEUX V,VAN DER P Y L,CHATAUD J,et al.Purification and characterization of anti-Listeriacompoundsproduced by Geotrichum candidum［J］.Appl Environ Microbiol,1998,64(2)：800-803.

［4］LIND H,SJ?GREN J,GOHIL S,et al.Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains［J］.FEMS Microbiol Lett,2007,271(2)：310-315.

［5］YU S,JIANG H,JIANG B,et al.Characterization of D-lactate dehydrogenase producing D-3-phenyllactic acid from Pediococcus pentosaceus［J］.Biosci Biotech Biochem,2012,76(4)：853-855.

［6］MU WM,YU SH,ZHU L J,et al.Production of 3-phenyllactic acid and 4-hydroxyphenyllactic acid by Pediococcus acidilactici DSM 20284 fermentation［J］.Eur Food Res Technol,2012,235(3)：581-585.

［7］ZHENGZJ,MA CQ,GAOC,et al.Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells of Bacillus coagulans SDM［J］.PLoS ONE,2011,6(4)：1-7.

［8］MU W,YU S,ZHU L,et al.Recent research on 3-phenyllactic acid,a broad-spectrum antimicrobial compound ［J］.App Microb Biotechnol,2012,95(5)：1155-1163.

［9］王立梅,騰 宇,陳文飛,等.pH值及底物對(duì)副干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸的影響［J］.食品科學(xué),2014,35(1)：163-166.

［10］ZAVALETA O C,MALO A L,MENDOZA A H,et al.Antifungal activity of lactobacilli and its relationship with 3-phenyllactic acid production［J］.Int J Food Microbiol,2014,173(3)：30-35.

［11］MU W M,CHEN C,LIX F,et al.Optimization of culture medium for theproduction of phenyllactic acid by Lactobacillus sp.SK007［J］.Bioresource Technol,2009,100(3)：1366-1370.

［12］李 芬,劉 晨,梁茜茜,等.植物乳桿菌UN-30菌株高產(chǎn)苯乳酸的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國(guó)食品添加劑,2016(8)：135-141.

［13］潘 龍,靳魁奇,劉宇鵬,等.靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化赤蘚糖醇生產(chǎn)L-赤蘚酮糖條件優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(12)：72-76.

［14］李明華,孟秀梅,徐詠梅.苯乳酸高產(chǎn)乳酸菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性的研究［J］.中國(guó)食品添加劑,2017(10)：85-90.

［15］李興峰,江 波,潘蓓蕾,等.苯丙氨酸及苯丙酮酸對(duì)Lactobacillus sp.SK007合成苯乳酸的影響［J］.過(guò)程工程學(xué)報(bào),2007,7(6)：1201-1206.

［16］JIA J,MU W,ZHANG T,et al.Bioconversion of phenylpyruvate to phenyllactate：gene cloning,expression,and enzymatic characterization of D-and L-lactatedehydrogenasesfrom Lactobacillusplantarum SK002［J］.Appl Biochem Biotechnol,2010,162(1)：242-251.

［17］ZHENG Z,ZHAO M,ZANG Y,et al.Production of optically pure L-phenyllactic acid by using engineered Escherichia coli coexpressing L-lactate dehydrogenase and formate dehydrogenase［J］.J Biotechnol,2015,207(8)：47-51.

［18］HABERLAND J,KRLEGESMANN A,WOLFRAM E,et al.Diastereoselective synthesis of optically active(2R,5R)-hexanediol［J］.Appl Microb Biotechnol,2002,58(5)：595-599.

［19］LI X,JIANG B,PAN B.Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp［J］.Biotechnol Lett,2007,29(4)：593-597.

［20］朱銀龍,贠軍賢,沈紹傳,等.透性化干酪乳桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯乳酸［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2015,29(2)：495-500.