王曉丹,羅小葉,邱樹毅*

(1.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025)

茅臺大曲是一種高溫大曲,是通過傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的方法,在65℃條件下,用小麥加母曲經過60 d的發(fā)酵自然形成的一個含有多種微生物體系的發(fā)酵制品［1-3］。由于多種微生物富集在大曲里且在制曲過程中自然生長起來,因此,整個大曲微生物復雜而多樣。目前,本課題組前期已經采用純培養(yǎng)技術及分子生物學手段對茅臺大曲中的細菌、霉菌及酵母菌進行了深入的研究,證實了茅臺大曲中細菌的生香動力、霉菌的糖化主力及酵母的酒醅發(fā)酵原動力的作用,詮釋了茅臺大曲中微生物在大曲酒的品質及風味呈現方面的重要作用［4-6］。

放線菌是大曲“菌系”中的一類具有較高鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的革蘭氏陽性細菌,其能產生豐富的活性次生代謝產物,是一種重要的微生物類群。在傳統(tǒng)白酒生產領域有關放線菌的研究主要集中在白酒發(fā)酵過程中酒醅、大曲、窖泥、發(fā)酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定［7-9］,并對其釀造相關的放線菌揮發(fā)性物質及代謝酶活性進行了研究［10-11］。同時,放線菌作為抗生素的主要生產菌株,在其他領域的研究較為深入；但作為白酒釀造的四大菌類之一,其某些獨特的代謝產物具有土味等特征,在白酒釀造過程中影響著酒體的風味及風格；然而,相對于其他三大類微生物,放線菌在白酒釀造過程中的作用還沒被引起足夠的重視［12］。目前,研究人員僅對茅臺大曲生產過程中周圍土壤及糟醅中的放線菌進行了研究［13］,對茅臺大曲中放線菌的種類及功能鮮有研究報道。

本研究建立了一種有效的高溫放線菌分離篩選方法,通過形態(tài)學、生理生化及26SrDNA分子生物學對篩選的高溫放線菌進行了鑒定,并采用大曲酶系酶活力測定方法對其酶活性質及通過固態(tài)微萃取與氣相色譜-質譜聯用(gaschromatography-massspectrometer,GC-MS)技術對發(fā)酵代謝產物成分進行了分析,為了解放線菌在茅臺大曲中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

茅臺大曲來源于貴州茅臺酒股份有限公司的茅臺酒車間生產用高溫大曲,產地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺鎮(zhèn)(東經106°22′、北緯27°51′、海拔423m)。大曲樣品為已經在車間貯存半年且準備用于生產的已經粉碎成20目的曲粉,在混合好的曲粉袋中按上、中、下層分別隨機取20個樣品,再經過充分混合后,迅速放入無菌保鮮袋中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒：美國BIOMIGA公司；萘啶酮酸、制霉菌素：上海源葉生物科技有限公司；新生霉素：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基(M1)、ISP2培養(yǎng)基(M2)、ISP3培養(yǎng)基(M3)、ISP4培養(yǎng)基(M4)、ISP5培養(yǎng)基(M5)、R2A培養(yǎng)基(M6)、淀粉-甘油培養(yǎng)基(M7)、GYM培養(yǎng)基(M8)、GTY培養(yǎng)基(M9)、HV培養(yǎng)基(M10)：實驗室自制。

純化及菌種保藏培養(yǎng)基采用ISP2培養(yǎng)基：分別稱取酵母提取物4 g,麥芽提取物1 g,葡萄糖4 g及瓊脂15 g,用1 L蒸餾水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液調pH值為7.3,121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母膏4 g、蛋白胨4 g、酵母浸粉4 g、K2HPO44 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g,用1L蒸餾水溶解,然后用5mol/LNaOH溶液調pH值為7.2～7.4,然后121℃滅菌20 min。

酶活力測定培養(yǎng)基采用麩皮培養(yǎng)基：稱取麩皮15 g,用15 mL蒸餾水攪拌均勻,然后121℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵產香培養(yǎng)基：將粉碎的高粱與未粉碎的高粱按質量比為3∶1進行混合,然后將混合的高粱與粉碎的小麥按質量比為1∶1進行混合,加入40%的水混合均勻,潤糧24 h后用瓶進行分裝(50 g/瓶),用8層紗布進行封口,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

庫爾特BECKMAN離心機：美國貝克曼庫爾特中國有限公司；Flex cycler多功能聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction,PCR)儀：德國耶拿分析儀器股份公司；DYCP44P電泳儀：北京欣惠澤奧科技有限公司；ZF25凝膠成像儀：上海方畦儀器有限公司；S3400N掃描電鏡：日本日立有限公司；FD-1C-80冷凍干燥機：上海喬躍電子有限公司；HP6890/5975C氣質聯用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法

(1)樣品預處理

干熱處理(A1)：用滅菌的燒杯稱取10g茅臺大曲樣品,然后將燒杯封口并置于100℃烘箱中加熱1 h；最后將大曲樣品放入含有90mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角瓶中,然后50℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min備用；濕熱處理(A2)：稱取10 g茅臺大曲樣品放入含有90 mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒瓶置于50℃、200 r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30min；先干熱后濕熱處理(A3)：經干熱處理的茅臺大曲樣品懸浮液在50℃恒溫水浴鍋中熱處理10 min；CaCO3富集培養(yǎng)(A4)：按照大曲樣品與CaCO3質量比為10∶1的比例在無菌燒杯中混合,添加適量無菌水,在濕度為30%、溫度為28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,然后放入含有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒杯置于50℃、200 r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30 min后備用；先CaCO3富集培養(yǎng)后再進行濕熱處理(A5)。

(2)分離培養(yǎng)基的選擇

在45～60℃溫度下,比較5種預處理方法的樣品在10種分離培養(yǎng)基上的生長狀況。

(3)篩選溫度的設置

分離篩選溫度分別設置為45℃、50℃、55℃及60℃。

(4)稀釋液的篩選

分別選擇無菌生理鹽水(質量濃度為9 g/L)及羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)水溶液(質量濃度為2.5 g/L)作為稀釋液［15］。

(5)抑制劑的添加

用0.1 mol/L NaOH溶液將萘啶酮酸配制成質量濃度為50 mg/L(A1)、100 mg/L(A2)及150 mg/L(A3)的溶液；用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液將制霉菌素配制成質量濃度為20mg/L(B1)、40mg/L(B2)及60mg/L(B3)的溶液；用無菌水將新生霉素配制成質量濃度為30mg/L(C1)、40 mg/L(C2)及50 mg/L(C3)的溶液；用無菌水將重鉻酸鉀配制成質量濃度為25 mg/L(D1)、50 mg/L(D2)及75 mg/L(D3)的溶液。同時,抑制劑均用0.22μm的無菌濾膜過濾,然后加入到滅菌培養(yǎng)基中混勻,倒入培養(yǎng)皿中［16］。其中,抑制劑的添加組合如表1所示。

表1 抑制劑的添加組合Table 1 Adding combination of inhibitors

(6)分離涂布的方法

稱取10g茅臺大曲樣品加入到含有90mL無菌稀釋液并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,將三角燒杯置于28℃、200r/min的恒溫水浴鍋中振蕩培養(yǎng)30 min。然后取1 mL上述樣品懸浮液進行10倍梯度稀釋,分別取0.2 mL各稀釋度菌懸液涂布于分離培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)基置于45℃、50℃、55℃及60℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),并進行分離純化,分離得到的菌株用ISP2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng),并在4℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 菌種的鑒定

(1)形態(tài)培養(yǎng)特征觀察

菌株的培養(yǎng)特征觀察參照國際鏈霉菌計劃(international streptomyces project,ISP)中有關放線菌的培養(yǎng)特征進行觀察［17］。

(2)掃描電鏡觀察

用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)48 h后,離心后棄上清,加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer solution,PBS)(分別稱取2.6g NaH2PO4·H2O及29 g Na2HPO4·12H2O,用500 mL蒸餾水溶解)洗滌菌體3次；向菌體沉淀中加入2.5%戊二醛固定液1.5 mL,4℃固定過夜；用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/乙醇混合液進行脫水,每次5 min,再用100%叔丁醇脫水2次,每次5 min；然后冷凍干燥4 h,干燥后的粉末樣品鍍金膜,用掃描電鏡進行觀察［18-19］。

(3)生理生化特征鑒定

對放線菌進行明膠液化實驗、淀粉水解實驗、碳源利用實驗、纖維素分解實驗、硝酸鹽實驗及牛奶凝固與胨化實驗,并參照《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的標準培養(yǎng)基和常用生理生化方法培養(yǎng)、觀察和記錄［14］。

(4)分子生物學鑒定

采用細菌基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒進行DNA提取,以F(5‘-CCTACGGGAGGCAGCAG-3‘)及R(5‘-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3‘)為引物進行PCR擴增,PCR擴增程序為94℃預變性5min,然后94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30個循環(huán),最后72℃延伸9 min；取2μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA提取效果；PCR產物在上海立菲生物工程技術服務有限公司進行測序；將測序數據在美國國家生物技術信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)數據庫中進行同源序列搜索,用MEGA 5.05軟件進行多序列比對,然后用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 放線菌粗酶液的制備及酶活力的測定

(1)粗酶液的制備

用接菌環(huán)取兩環(huán)活化的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,45℃培養(yǎng)2 d,然后以10%的接種量接種到麩皮培養(yǎng)基中,再45 ℃培養(yǎng)5 d,所得培養(yǎng)物與水按照1∶10(g∶mL)的比例混合攪勻,40℃水浴1 h,每隔15 min攪拌1次,最后進行過濾,所得濾液為粗酶液。

(2)酶活力的測定

糖化型淀粉酶與纖維素酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法；酸性蛋白酶活力的測定根據商業(yè)行業(yè)標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中的方法進行測定；脂肪酶活力的測定根據國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的動態(tài)滴定法進行測定；果膠酶活力的測定根據輕工業(yè)行業(yè)標準QB 1502—1992《食品添加劑——果膠酶制劑》中的方法進行測定。

糖化型淀粉酶酶活定義：在40℃、pH4.6條件下,1h水解淀粉產生1 mg葡萄糖作為一個酶活力單位。纖維素酶酶活定義：50℃條件下,1 min催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位(U/g)。蛋白酶酶活定義：在40℃條件下1 min水解酪蛋白產生lμg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位(U/g)。脂肪酶酶活定義：1mL酶液在40℃,pH7.5條件下,1 min水解底物生成1μmol可滴定的脂肪酸為一個酶活力單位(U/g)。果膠酶酶活定義：1 mL酶液在50℃、pH3.5的條件下,1 h分解果膠產生l mg半乳糖醛酸為一個酶活單位(U/g)。

1.3.4 放線菌固態(tài)發(fā)酵產物的香氣成分測定

放線菌固態(tài)發(fā)酵產物的香氣成分測定采用氣質聯用法。用接菌環(huán)取兩環(huán)活化的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,45℃培養(yǎng)2 d,以10%的接種量接入高粱與小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,再45℃培養(yǎng)7 d。均勻取樣品約10 g,置于50 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入手動進樣器,在50℃左右萃取40min后取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250℃)中,熱解吸3 min后進樣。氣相色譜條件：色譜柱為Zebron ZB-5MSI彈性石英毛細管柱(30cm×0.25mm×0.25μm),柱溫為40℃,保留時間為2 min,以5℃/min升溫至270℃,運行時間為48 min,汽化室溫度為250℃,載氣為高純He(99.999%),柱前壓為7.62 psi,載氣流量為1 mL/min,不分流進樣,溶劑延遲時間為1 min。質譜條件離子源為電子電離(electronic ionization,EI)源,離子源溫度為230℃,四極桿溫度為150℃,電子能量為70eV,發(fā)射電流為34.6μA,倍增器電壓為1 294 V；接口溫度為280℃,質量范圍為20～450 amu。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統(tǒng)檢索及核對NIST2005和Wiley275標準質譜圖,確定揮發(fā)性化學成分,用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 分離篩選條件的確定

在45～60℃條件下比較了5種預處理方法處理的樣品在10種分離培養(yǎng)基上的生長狀況,結果見表2。由表2可知,使用ISP2培養(yǎng)基(M2)、R2A培養(yǎng)基(M6)、GYM培養(yǎng)基(M8)及GTY培養(yǎng)基(M9)為分離培養(yǎng)基,樣品用A5預處理方法,羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose-Na,CMC-Na)作為稀釋劑,B1C1組合為抑制劑,在45℃及50℃溫度下,均能生長出具有細菌或放線菌形態(tài)特征的菌落。說明Ca2+對穩(wěn)定酶的結構和耐高溫都有重要作用,且濕熱處理能夠有效促進嗜熱放線菌孢子的萌發(fā)［20］；同時,由于羧甲基纖維素鈉水溶液具有較好的懸浮作用,并且其穩(wěn)定性好、無毒,在食品領域常被作為分散劑使用［21］,因此,在分離放線菌時羧甲基纖維素鈉是一種有效的稀釋劑。同時,B1C1抑制劑組合的分離效果優(yōu)于萘啶酮酸和制霉菌素組合的分離效果。

表2 預處理方法的選擇Table 2 Selection of pretreatment methods

2.2 分離菌株的鑒定

從茅臺大曲中分離純化出1株具有放線菌菌落形態(tài)特征菌株,本實驗室保藏編號為FBKL4.004。該菌的篩選方法：預處理方法為A5,稀釋劑為CMC-Na,分離培養(yǎng)基為GTY培養(yǎng)基,抑制劑為B1C1,培養(yǎng)溫度為45℃及50℃。對菌株FBKL4.004進行形態(tài)學特征、生理生化實驗及分子生物學鑒定。

(1)形態(tài)學特征

菌株FBKL4.004菌落形態(tài)及掃描電鏡結果見圖1。由圖1a可知,菌株FBKL4.004單菌落形狀為圓形,基內菌絲為棕黃色,氣生菌絲為灰白色,菌落平坦、干燥致密,且無可溶性色素產生。由圖1b可知,通過掃描電鏡觀察FBKL4.004的特征,菌株FBKL4.004菌絲細長,有直鏈狀的孢子,孢子未分散,菌絲表面有附著物。

圖1 菌株FBKL4.004菌落形態(tài)(a)及掃描電鏡圖(b)Fig.1 Colonial morphology(a)and scanning electron microscope(b)of strain FBKL4.004

(2)生理生化特征

菌株FBKL4.004的生理生化試驗包括明膠液化、淀粉水解、碳源利用、牛奶凝固與胨化、纖維素分解等,結果見表3。

表3 菌株FBKL4.004生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical properties of strain FBKL4.004

由表3可知,菌株FBKL4.004能利用碳源范圍較廣,葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖等均能利用,能使淀粉水解和纖維素分解,明膠液化實驗中使明膠凝固,使牛奶酶凝產酸。

(3)分子生物學鑒定

圖2 菌株FBKL4.004 16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of strain FBKL4.004

圖3 菌株FBKL4.004的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL4.004 based on 16S rDNA gene sequence

以放線菌株FBKL4.004基因組DNA為模板進行PCR擴增,其PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。由圖2可知,菌株FBKL4.004PCR擴增結果在400bp處出現明顯條帶?；蛐蛄袦y定后,測序結果在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST),用MEGA5.05軟件進行多序列比對,鄰接(NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖3。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》、《鏈霉菌鑒定手冊》,結合菌株FBKL4.004形態(tài)、生理生化特征及分子生物學比對分析,菌株FBKL4.004與Streptomyces bangladeshensis(NR043164)聚為一類,其同源性為98%,因此將菌株FBKL4.004鑒定為Streptomyces bangladeshensis。該菌于2005年首次從孟加拉國納托爾的土壤中分離到,被歸類到鏈霉菌屬的一個新物種,其16SrRNA比對分析與嗜熱鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)有較高的同源性［22］,對革蘭氏陽性菌及某些致病真菌有抗菌活性［23-24］,具有生物降解聚(β-羥基丁酸酯)的作用［25］。

2.3 放線菌的產酶特性

醬香大曲的酶系主要有液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、單寧酶、果膠酶、酯化酶及漆酶等酶類。本研究對嗜熱放線菌(Streptomycesbangladeshensis)FBKL4.004在釀造過程中產生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、糖化酶及纖維素酶的活性進行了研究,結果見表4。由表4可知,各種酶的酶活力差異較大,其中酸性蛋白酶和纖維素酶的酶活比較低,分別為3.34 U/g、2.07 U/g,產糖化酶及果膠酶活力最高,分別為345.03 U/g及318.57 U/g。

表4 菌株FBKL4.004酶活力測定結果Table 4 Determination results of enzyme activity from strain FBKL4.004

2.4 放線菌固態(tài)發(fā)酵香氣成分分析

圖4 菌株FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵產物揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ions chromatogram of volatile compounds of strain FBKL4.004 solid-state fermentation

對從茅臺大曲中分離得到的嗜熱放線菌株FBKL4.004進行了固態(tài)發(fā)酵,并通過固態(tài)微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術對其揮發(fā)性成分組成及風味成分進行了測定,總離子流色譜圖結果見圖4,各香氣成分鑒定結果見表5。

表5 菌株FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵產物揮發(fā)性成分組成分析結果Table 5 Analysis results of volatile components in strain FBKL4.004 solid-state fermentation products

由表5可知,嗜熱放線菌FBKL4.004固態(tài)發(fā)酵代謝產物種類豐富,主要以酯類物質為主(34.57%),包括肉豆蔻酸甲酯、十二酸甲酯及14-甲基-十五烷酸甲酯等,其次是萜烯類物質(18.51%)及吡嗪類(17.63%)。

3 結論

本研究建立了一種有效的分離放線菌的方法,并從茅臺大曲中分離篩選出了1株嗜熱放線菌(Streptomyces bangladeshensis)FBKL4.004。通過對其酶活和固態(tài)發(fā)酵產物揮發(fā)性成分進行探討,發(fā)現該菌株產糖化酶和果膠酶的能力較為突出,分別為345.03 U/g及318.57 U/g；同時,通過對其固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分進行分析,發(fā)現酯類物質含量最高(34.57%),其次為萜烯類物質(18.51%)及吡嗪類物質(17.63%)。本研究為發(fā)現固態(tài)發(fā)酵中更多的微生物資源及其在白酒發(fā)酵生產中的作用及應用奠定了基礎。

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