董瑞真,李丕武,石 鳳,李 康,汪俊卿*

(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250353)

氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)也稱葡萄糖胺,是一種重要的功能性單糖,可作為食品配料使用,還是結(jié)締組織和胃腸道結(jié)膜中糖蛋白的天然成分［1］。在呼吸系統(tǒng)的粘液分泌物中GlcN也發(fā)揮著作用［2］。MCALINDON TE等［3］認(rèn)為GlcN能緩解關(guān)節(jié)炎疼痛。RICHY F等［4］認(rèn)為GlcN可治療膝骨關(guān)節(jié)炎。GlcN的生產(chǎn)方法主要有甲殼素水解法和酶生物轉(zhuǎn)化法［5］以及微生物發(fā)酵法［6］。甲殼素水解法的原料貝殼類生產(chǎn)的GlcN易對(duì)人體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),該方法消耗大量的酸堿導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重［7］。酶生物轉(zhuǎn)化法所需的甲殼素酶的價(jià)格高增加了生產(chǎn)成本［8］。微生物發(fā)酵法利用微生物代謝合成GlcN,在基因水平上對(duì)菌種進(jìn)行改造具有廣闊的發(fā)展空間［5］。微生物發(fā)酵法具有原料來(lái)源易獲得,發(fā)酵時(shí)間比較短,對(duì)環(huán)境污染小以及服用不會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［9-13］。

已有利用Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌(Escherichia coli)的甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因(manX)和乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因(nagE)以及葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因(ptsG),減少了發(fā)酵液中氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)還分別敲除了糖酵解途經(jīng)相關(guān)基因丙酮酸激酶編碼基因pykA和pykF,氨基葡萄糖總產(chǎn)量有所提高［9］。但是在現(xiàn)有改造條件下,細(xì)胞中依然存在著氨基葡萄糖的消耗途徑,本實(shí)驗(yàn)敲除glmU基因葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域,減少氨基葡萄糖的消耗途徑。

GlmU蛋白是由456個(gè)氨基酸組成的雙官能團(tuán)酶,有尿苷酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶兩種活性［14］。大腸桿菌(E.coli)的glmU蛋白參與細(xì)胞壁肽聚糖和脂多糖的合成［15］。作為雙功能酶的glmU在醫(yī)學(xué)界被認(rèn)為是細(xì)菌靶,因?yàn)間lmU蛋白的抑制能導(dǎo)致細(xì)胞壁的分解使細(xì)胞死亡［16］。在原核生物中催化從葡萄糖胺-1-磷酸(glucosamine-1-phosphate,GlcN-1P),乙酰輔酶A(coenzymeA,CoA)和三磷酸尿苷(uridinetriphosphate,UTP)形成二磷酸尿苷(Uridinediphosphate,UDP)-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)［17］。圖1是E.coli BL21細(xì)胞內(nèi)氨基葡萄糖的代謝途徑,敲除葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域來(lái)積累氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖。弱化glmU功能可以減弱氨基葡萄糖-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate,GlcN-6P)向UDP-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)方向的流失,積累了GlcN-6P。GlcN-6P向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)去磷酸化,產(chǎn)生GlcN。

圖1 E.coli BL21氨基葡萄糖代謝途徑Fig.1 Metabolism pathway of E.coli BL21

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

大腸桿菌(E.coli)BL21：上海北諾生物科技有限公司；E.coli DH5α：實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；提供抗性基因ampR的質(zhì)粒pHT01：寶生物工程(大連)有限公司；所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.1.2 試劑

FastDigest HindⅢ：賽默飛世爾科技有限公司；基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒：北京艾德萊生物科技有限公司。

0.257 mol/L四硼酸鉀試液、對(duì)二甲氨基苯甲醛試液、Ehrlich試劑、乙酰丙酮試劑：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,pH 7.0。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉1 g/L,KH2PO417 mmol/L,K2HPO472 mmol/L,MgSO415 mmol/L,FeCl30.025 g/L,MnCl215 mg/L,(NH4)2SO43 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

OLABO-100C恒溫振蕩搖床：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；ProFlex聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)儀：賽默飛世爾科技有限公司；DYY-12型電泳儀：北京市六一儀器廠；MD2000H核酸超微量系列分光光度計(jì)：英國(guó)BioFuture公司；804R型離心機(jī)、4308型電轉(zhuǎn)儀：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 制備glmUⅠ-ampR重組同源性片段

圖2 E.coli BL21ΔglmU構(gòu)建流程圖Fig.2 Flowchart of E.coli BL21ΔglmU construction

用同源單交換的方法敲除glmU基因,提取E.coli BL21基因組,引物glmUF1和glmUR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度為603 bp的同源臂glmUⅠ；引物glmU F2和glmU R2擴(kuò)增pHT01上的1 328 bp抗性基因片段ampR；glmUⅠ與ampR分別連接至CV08-pZERO-Blunt質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中,寄到測(cè)序公司測(cè)序,分別選取正確的基因序列,glmU F1和glmU R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增重疊延伸PCR,獲得長(zhǎng)度為1 931 bp的同源重組片段glmUⅠ-ampR(見(jiàn)圖2)。

1.3.2 glmUⅠ-ampR片段的酶切、濃縮

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切g(shù)lmUⅠ-ampR基因片段后：加入酶切液1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的無(wú)水乙醇,放在-20℃冰箱中1 h,12 000 r/min離心3 min棄掉上清液,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇重懸清洗沉淀,離心除去乙醇,最后加入20μLddH2O重懸DNA［18］。用核酸超微量分光光度計(jì)測(cè)定glmUⅠ-ampR片段質(zhì)量濃度在500 ng/μL左右。

1.3.3 制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化

詳細(xì)步驟參考朱森康等［19］制備感受態(tài)細(xì)胞的方法。

100μL感受態(tài)細(xì)胞與10μL glmUⅠ-ampR濃縮片段混合后再加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中冰浴10 min后立即電轉(zhuǎn)化(2 500 V,25 mF,5 ms)。電擊后立即加入1 mL LB培養(yǎng)基,復(fù)蘇2 h左右,將細(xì)胞液涂布在含有抗生素ampR的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。

1.3.4 篩選陽(yáng)性重組菌株

從抗性平板上挑取單菌落接種到含ampR抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后,提取基因組,用glmU F1和glmU R2做菌落PCR驗(yàn)證,選出陽(yáng)性重組菌株。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

為了使重組菌發(fā)酵效果更顯著,因此需要對(duì)培養(yǎng)基成分優(yōu)化。分別對(duì)葡萄糖(20g/L、40g/L、50g/L、60 g/L),蛋白胨(5 g/L、10 g/L、15 g/L、20g/L),酵母浸粉(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L),MnCl2(5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L)添加量進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)與氨基葡萄糖的測(cè)定

將E.coli BL21和E.coli BL21ΔglmU分別接種于50 mL LB培養(yǎng)基中,待OD600nm≈4時(shí),取種子液轉(zhuǎn)接于含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中。接種量為10%,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng),每隔2 h用10 mol/L KOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為7.0,每種菌做3組平行。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氨基葡萄糖與N-乙酰氨基葡萄糖的濃度參考文獻(xiàn)［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除片段glmUⅠ-amp R的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)化及篩選

PCR擴(kuò)增結(jié)果都用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知,條帶與理論長(zhǎng)度603 bp相符,表明獲得glmU基因同源臂glmUⅠ；由圖3(b)可知,條帶與理論長(zhǎng)度1 328 bp相符,表明獲得ampR片段；由圖3(c)可知,條帶與理論長(zhǎng)度1 931 bp相符,表明獲得glmUⅠ-ampR；由圖3(d)可知,出現(xiàn)了glmUⅠ-ampR片段1 931 bp長(zhǎng)度的條帶,表明電轉(zhuǎn)成功,獲得E.coli BL21ΔglmU菌株。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

葡萄糖添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,葡萄糖添加量為40g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)果最理想。如葡萄糖添加量過(guò)高,菌體就會(huì)產(chǎn)生大量乙酸和副產(chǎn)物,不僅抑制菌體生長(zhǎng)而且干擾發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生［21］。

蛋白胨添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,蛋白胨添加量為10 g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)果最理想。初步推測(cè)繼續(xù)增大蛋白胨添加量,發(fā)酵液黏度會(huì)增加,溶解氧含量減少,氨糖產(chǎn)量反而有所下降,培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)高使菌體代謝廢物增多［22］。

酵母粉添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,酵母粉添加量為1 g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)果最理想。酵母粉添加量＞1 g/L時(shí),隨酵母粉添加量增大,氨基葡萄糖產(chǎn)量下降。

氯化錳添加量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,氯化錳添加量最優(yōu)為15 mg/L,再增大其添加量,氨基葡萄糖產(chǎn)量略微減小。

表3 蛋白胨添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Table 3 Effect of peptone addition on fermentation results

表4 酵母粉添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Table 4 Effect of yeast powder addition on fermentation results

表5 氯化錳添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Table 5 Effect of manganese chloride addition on fermentation results

2.3 工程菌發(fā)酵結(jié)果

用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵,將E.coli BL21ΔglmU和E.coli BL21的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4a可知,兩種菌發(fā)酵2～10 h時(shí),生長(zhǎng)速度基本一,12 h后E.coli BL21ΔglmU生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,12～16 h E.coli BL21生長(zhǎng)加快,16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,E.coli BL21ΔglmU的生長(zhǎng)穩(wěn)定期比E.coli BL21提前4 h。從總體趨勢(shì)來(lái)看,相同培養(yǎng)條件下,E.coli BL21ΔglmU的OD600nm值明顯低于E.coli BL21,表明glmU基因的敲除影響了菌體的生長(zhǎng)。

由圖4b可知,兩種菌以4.0%葡萄糖為底物時(shí),發(fā)酵液中的葡萄糖最后都未完全消耗完,E.coli BL21的葡萄糖消耗了85.25%,BL21ΔglmU消耗了77.75%,E.coli BL21的葡萄糖消耗略高于BL21ΔglmU。glmU的敲除對(duì)葡萄糖代謝影響不大。

由圖4c可知,E.coli BL21發(fā)酵10 h時(shí),發(fā)酵液中的乙酰氨基葡萄糖含量最高僅為7.2 mg/L,E.coli BL21ΔglmU發(fā)酵液中的乙酰氨基葡萄糖最高為發(fā)酵18 h時(shí)的36.76 mg/L,約為E.coli BL21的5.11倍。從發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)來(lái)看,E.coli BL21 ΔglmU的乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量始終高于E.coli BL21。

圖4 E.coli BL21和E.coli BL21ΔglmU發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Fig.4 Comparison of fermentation results of E.coli BL21 and E.coli BL21ΔglmU

由圖4d可知,發(fā)酵至14 h時(shí),E.coli BL21ΔglmU的發(fā)酵液中的氨基葡萄糖積累量達(dá)到最高值1049.6mg/L,發(fā)酵至12 h時(shí),E.coli BL21的發(fā)酵液中的氨基葡萄糖積累量達(dá)到最高值103.34 mg/L。從發(fā)酵過(guò)程來(lái)看,E.coli BL21ΔglmU的氨基葡萄糖產(chǎn)量明顯增多,是E.coli BL21的10.2倍,表明glmU是氨基葡萄糖代謝的關(guān)鍵基因。

3 結(jié)論

利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取glmUⅠ同源臂和抗性基因ampR,利用重疊延伸PCR將兩者連接組成glmUⅠ-ampR,將其整合到基因組上,完成葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域部分的敲除。若glmU基因完全敲除則使細(xì)胞壁裂解,但敲除葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域部分使雙功能酶glmU功能缺失不會(huì)使細(xì)胞死亡。因此,在生長(zhǎng)初期,重組菌的生長(zhǎng)速度略慢于原始菌株,生長(zhǎng)穩(wěn)定期E.coli BL21ΔglmU的OD600nm值為E.coli BL21的67.6%。

本實(shí)驗(yàn)首次將雙功能glmU的第二結(jié)構(gòu)域敲除阻斷了從GlcN-6P到UDP-GlcNAc的代謝途徑,積累了GlcN-6P,更多的GlcN-6P向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)并脫磷酸,因此發(fā)酵液中的氨基葡萄糖多于E.coli BL21。初步發(fā)酵研究以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖時(shí)重組菌株E.coli BL21ΔglmU氨基葡萄糖產(chǎn)量為1 049.6 mg/L,是E.coli BL21的10.2倍。在此之前,已有許多有關(guān)氨基葡萄糖代謝控制的其他基因的研究,如葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase,GlmS)是各種物種生物合成氨基葡萄糖的關(guān)鍵酶,其谷氨酰胺酶結(jié)構(gòu)域催化谷氨酰胺向谷氨酸的轉(zhuǎn)化并釋放出氨［23］,將E.coli的乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因nagE和甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因manX敲除,阻斷胞外GlcN向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)［24］。一系列基因水平的改造［25］提高了氨基葡萄糖產(chǎn)量,本實(shí)驗(yàn)為生產(chǎn)氨基葡萄糖的碳代謝途徑改造提供了新思路,對(duì)氨基葡萄糖代謝通路上的關(guān)鍵基因的研究做了實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充。

參考文獻(xiàn)：

［1］XING R,LIU S,GUO Z,et al.The antioxidant activity of glucosamine hydrochloride in vitro［J］.Bioorg Med Chem,2006,14(6)：1706-1709.

［2］SANTHOSH S,MATHEWPT.Preparation and propertiesof glucosamine and carboxymethylchitin from shrimp shell［J］.J Appl Polym Sci,2008,107(1)：280-285.

［3］MCALINDON T E,LA V M P,FELSON D T.Efficacy of glucosamine and chondroitin for treatment of osteoarthritis［J］.Jama,2000,283(11)：1469-1475.

［4］RICHY F,BRUYEREO,ETHGEN O,et al.Structural and symptomatic efficacy of glucosamineand chondroitin in knee osteoarthritis：acomprehensivemeta-analysis［J］.Arch Int Med,2003,163(13)：1514-1522.

［5］SASHIWA H,FUJISHIMA S,YAMANON,et al.Production of N-acetyl-D-glucosaminefromα-chitin by crudeenzymesfrom Aeromonashydrophila H-2330［J］.Carbohyd Res,2002,337(8)：761-763.

［6］DENGM D,WASSINK SL,GRUND A D.Engineering a new pathway for N-acetylglucosamine production：Coupling a catabolic enzyme,glucosamine-6-phosphatedeaminase,with abiosynthetic enzyme,glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase［J］.Enzyme Microb Technol,2006,39(4)：828-834.

［7］MOJARRAD J S,NEMATI M,VALIZADEH H,et al.Preparation of glucosaminefrom exoskeleton of shrimp and predicting production yield by response surface methodology［J］.J Agr Food Chem,2007,55(6)：2246-2250.

［8］KUK JH,JUNG W J,JO G H,et al.Production of N-acetyl-beta-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp.GJ-18 crude enzyme［J］.Appl Microb Biot,2005,68(3)：384-389.

［9］陳 欣.代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過(guò)程優(yōu)化與控制［D］.無(wú)錫：江南大學(xué),2012.

［10］CHEN X,LIU L,LI J,et al.Improved glucosamine and N-acetylglucosamine production by an engineered Escherichia coli via step-wise regulation of dissolved oxygen level［J］.Bioresour Technol,2012,110：534-538.

［11］CHENX,LIU L,LIJ,et al.Optimization of glucosefeeding approaches for enhanced glucosamine and N-acetylglucosamine production by an engineered Escherichia coli［J］.J Ind Microbiol Biotechnol,2012,39：359-365.

［12］ZHANG J,LIU L,LIJ,et al.Enhanced glucosamine production by Aspergillus sp.BCRC 31742 based on thetime-variant kineticsanalysisof dissolved oxygen level［J］.Bioresource Technol,2012,111(5)：507-511.

［13］SITANGGANG A B,WU H S,WANG SS,et al.Effect of pellet size and stimulating factor on theglucosamine production using Aspergillus sp.BCRC 31742［J］.Bioresource Technol,2010,101(10)：3595-3601.

［14］GEHRINGA M,LEESW J,MINDIOLA D J,et al.Acetyltransfer precedes uridylyltransfer in the formation of UDP-N-acetylglucosamine in separable active sites of the bifunctional GlmU protein of Escherichia coli［J］.Biochemistry,1996,35：579-585.

［15］RASHMIS,CHITRA R,RUKMANKESH M,et al.Identification and characterization of novel small molecule inhibitors of the acetyltransferase activity of Escherichia coli N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase/glucosamine-1-phosphate-acetyltransferase(GlmU)［J］.Appl Microbiol Biot,2016,100(7)：3071-3085.

［16］MEHRA R,SHARMA R.Identification and optimization of Escherichia coli GlmU inhibitors：an in silico approach with validation thereof［J］.Eur J Med Chem,2015,92：78-90.

［17］WANG S S,FU X,LIU Y P,et al.Probing the roles of conserved residues in uridyltransferase domain of Escherichia coli K12 GlmU by site-directed mutagenesis［J］.Carbohyd Res,2015,413：70-74.

［18］趙慶萱,石樂(lè)琴,王春暉.不同純化方法處理DNA合成引物對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響［J］.生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,1997,25(3)：65-67.

［19］朱森康,黃 磊,李燕飛,等.制備高效大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和電轉(zhuǎn)化條件的研究［J］.生物技術(shù)通報(bào),2011,37(10)：206-209.

［20］張惟杰,李玲如.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社,1999：18-20.

［21］劉兆巍,薛亞平,鄭裕國(guó).重組大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中乙酸的控制［J］.發(fā)酵科技通訊,2014,43(2)：21-26.

［22］李 民,陳常慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志,2000,20(2)：26-31.

［23］WEIWL,GERALD M,JAMESWG.Computational insightsinto substrate binding and catalytic mechanism of the glutaminase domain of glucosamine-6-phosphate synthase(GlmS)［J］.RSC Adv,2017,7(47)：29626-29638.

［24］陳 欣,劉 龍,李江華,等.Red同源重組敲除nagE和manX對(duì)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào),2012,28(3)：305-319.

［25］劉佃磊,李丕武,李瑞瑞,等.高產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào),2014,40(3)：36-41.