易凡利，王嘉福,2*，張福平，阮亦麒，唐靚婷，毛 寧，冉雪琴*

（1.貴州大學動物科學學院，農業(yè)生物工程研究院，貴州貴陽 550025；2. 銅仁學院，貴州銅仁 554300）

繁殖性狀尤其是多產性狀是生豬養(yǎng)殖業(yè)中重要的經濟性狀，近年來國內外眾多學者在繁殖性狀的基礎研究和應用方面開展了卓有成效的工作，為提高豬種的產仔數發(fā)揮了重要的作用。繁殖力是評估生豬養(yǎng)殖業(yè)生產效益的重要指標，對豬產仔數性狀的選育和改良是豬育種工作的主要目標之一[1-2]。根據遺傳育種學家Chris Haley的計算，如果母豬的產仔數每胎能提高1頭，英國就可以從生豬養(yǎng)殖業(yè)中每年增加7億英鎊的額外收入，而整個歐盟國家則可多獲利至少20億歐元[3]。

香豬是在一個獨特的自然生態(tài)條件和地理環(huán)境中，通過低水平的飼養(yǎng)管理方式以及長期的人工和自然近交選育形成的優(yōu)良地方豬品種[4]。然而，香豬較低的繁殖率限制了這種小型豬產業(yè)的發(fā)展，而且香豬繁殖力的調控機理尚未明確。

貴州香豬主產于貴州省從江縣的宰便、加鳩、加勉、加榜、光輝、剛邊、秀塘、東朗等8個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，近年來對貴州從江香豬的研究主要集中在生長性能、屠宰性能、繁殖性能等經濟性狀，以及個別基因的多態(tài)性分析[5-6]。迄今為止，國內外運用大白豬、長白豬、五指山豬、陸川豬、藏豬、太湖豬、榮昌豬等豬種進行的關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，豬繁殖性能的主效基因有ESR基因[7]、LHP基因[8]、MP7基因[9]等，而對于β-微精漿蛋白（MSMB）、前列腺素F2α受體（PTGFR）、分泌性白細胞蛋白酶抑制因子（SLPI）、抑制素A（INHA）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）基因與繁殖性狀的相關性研究尚少。前期研究中，本課題組從香豬卵巢轉錄組測序結果中篩選出5個候選基因，即MSMB、PTGFR、SLPI、INHA、SERPINE1，具有差異表達現(xiàn)象（待發(fā)表）。在此基礎上，本研究通過檢測5個基因在發(fā)情與未發(fā)情時期香豬卵巢和子宮組織中的表達變化，探討這些基因對香豬卵巢和子宮是否具有調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及組織樣品采集 實驗所用的香豬卵巢和子宮組織采自貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責任公司。隨機選擇發(fā)情期與未發(fā)情期的6月齡母香豬各3頭，屠宰后，無菌采取卵巢和子宮，裝入冷凍管，投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織樣品總RNA的提取及cDNA的合成 取-80℃凍結的50～100 mg組織樣品迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織直至成粉末，參照天根生化科技（北京）有限公司的RNAsimple總RNA提取試劑盒（DP419）提取總RNA。用NanoDrop2000（Thermo）對提取的RNA進行質檢，RNA純度通過計算OD260/280（介于1.90～2.10）進行評估，RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。反轉錄采用Promega生產的 -GoscriptTMReverse Transcription Mix，Oligo（dT）試劑盒，按照操作說明書完成cDNA的合成。

1.3 熒光定量PCR 利用在線Primer3.0設計引物，用Unafold（http://www.dtdna.com/UNAFOld）檢驗發(fā)夾結構，用Primer-BLAST（http://www.ncbi.n/m.nih.gov/tools/primer-blast）分析引物的特異性。由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成引物（表1）。熒光定量PCR檢測用天根SYBR?Green試劑盒，反應在CFX96 Connect TM（Bio-Rad）熒光定量PCR儀上進行，根據試劑盒操作說明進行擴增。每個樣品做3個重復。表1中qPCR擴增效率是用倍比稀釋的重組質粒為模板，熒光定量PCR儀的分析軟件（Bio-Rad）繪制的曲線計算而來。

1.4 統(tǒng)計分析 目標基因在各組織中的表達水平采用2-△△Ct法進行相對定量。以管家基因GAPDH為內參。用SPSS軟件進行t檢驗分析基因的差異表達。P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 香豬卵巢組織中基因的差異表達 由圖1可見，SLPI、INHA、SERPINE1、MSMB、PTGFR基因在香豬卵巢組織中發(fā)情與未發(fā)情時期均有表達。INHA基因發(fā)情時期的表達水平是未發(fā)情時期的12倍（P＜0.01）；SLPI基因發(fā)情時期的表達水平是未發(fā)情時期的5倍（P＜0.05）；MSMB在卵巢組織中發(fā)情時期的表達量顯著低于未發(fā)情期（P＜0.05）；SERPINE1基因、PTGFR基因在發(fā)情時期與未發(fā)情時期的表達水平差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 5個基因在發(fā)情、未發(fā)情時期香豬卵巢組織中的差異表達

2.2 香豬子宮組織中基因的差異表達 相對于未發(fā)情時期（圖2），SLPI基因在發(fā)情期子宮組織中的表達量極顯著升高（P＜0.01）；INHA、MSMB、PTGFR基因在發(fā)情期子宮的表達量顯著下降（P＜0.05）；SERPINE1基因的表達水平變化不明顯（P＞0.05）。

表1 熒光定量PCR引物序列及相關信息

圖2 5個基因在發(fā)情和未發(fā)情期香豬子宮組織中的差異表達

3 討 論

在母畜中，INHA的主要來源是卵巢，由卵巢的顆粒細胞和睪丸間質細胞分泌，在子宮中也有表達[10]。抑制素與性腺、子宮等組織的功能紊亂及妊娠的維持有密切關系[11]。豬卵泡中INHA在排卵前的表達量升高，中卵泡的表達水平低于大卵泡[12]。抑制素還有控制卵泡的發(fā)生、卵母細胞的成熟以及調節(jié)胚胎發(fā)育的作用[13]。本文檢測到INHA基因在發(fā)情期香豬卵巢中的表達水平極顯著高于未發(fā)情期；而在發(fā)情期子宮組織中的表達水平下降，說明該基因在香豬發(fā)情期的生理過程中，可能促進卵巢的生理功能、抑制子宮的功能。

SERPINE1和SERPINE2同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERPIN）超家族。研究表明[14]，SERPINE2是胎盤和子宮中主要的纖溶酶原激活劑（PA）的抑制劑。應用HPRL和HPRL+Kp作用于小鼠卵泡[15]，SERPINE1的表達水平變化不大。高催乳素血癥可明顯促進小鼠的排卵數，卻抑制女性卵泡的發(fā)育[16]。腎上腺素通過AngⅡ刺激SERPINE1基因的表達，從而影響子宮內膜基質細胞的蛻膜化[17]?？梢姡琒ERPINE1基因與PRLr、PA、AngⅡ之間可能存在著一定的聯(lián)系。本研究結果顯示，發(fā)情期SERPINE1基因的表達量在卵巢中升高、子宮中下降，但均未達顯著水平，說明該基因對卵巢、子宮生理功能的影響可能不大。

PTGFR是PGF2α的一個特異性受體，PGF2α通過PTGFR發(fā)揮生物學作用，其受體廣泛存在于肝臟、卵巢、子宮等的細胞膜上[18]，參與卵巢排卵和子宮分娩活動。在母豬懷孕期間以及子宮內膜植入期間，PGF2α的旁分泌和自分泌作用受PTGFR的調控[19-20]，PTGFR在優(yōu)勢卵泡和從屬卵泡中的表達量無顯著差異[21]。豬胚胎植入期子宮內膜中PTGFR的表達量高于植入前，且僅在子宮內膜上皮細胞中高表達[20]。本文的研究證實，發(fā)情與未發(fā)情時期香豬卵巢中PTGFR基因的表達水平無顯著差異，發(fā)情時期子宮中該基因的表達水平上調。提示PTGFR基因可能主要調控香豬子宮的功能。

MSMB是一種富含二硫鍵的低分子量蛋白質，是精液的主要成分，在生殖系統(tǒng)和黏膜中強烈表達，抑制精子的活力[22]。在高產、低產約克夏母豬中鑒定出SCARB1、MSMB等基因與繁殖力和產仔數相關[23]，MSMB可能是濾泡閉鎖的標記[24]。本研究結果顯示，無論在香豬卵巢組織中還是在子宮組織中，MSMB在發(fā)情時期的表達水平均低于未發(fā)情時期。推測MSMB基因可能對香豬卵巢和子宮的功能有調節(jié)作用。

SLPI是一種由黏膜被覆上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等分泌的上皮特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，存在于各種黏膜分泌液中，通過自分泌和旁分泌系統(tǒng)在細胞增殖和分化過程中起作用，且控制胚胎發(fā)育因子的表達[25]，SLPI在人子宮肌層中表達并在分娩后增加[26]。特別是在胚胎著床的動態(tài)重塑期間，SLPI與P4存在相互作用[27]。從本研究結果來看，發(fā)情時期香豬卵巢、子宮組織中的表達水平均顯著高于未發(fā)情時期，推測該基因可能影響香豬卵巢和子宮的生理功能。

本研究結果提示，INHA、SLPI、MSMB基因在香豬卵巢、子宮中均起到調節(jié)作用，而PTGFR僅在子宮中起調控作用，相關機理有待深入研究。

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