郭 磊,李開鋒,王述柏,張啟迪

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 威海 264200)

鴨大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的局部或全身性感染的細(xì)菌性疾病,其主要發(fā)病特征為心包炎、肝周炎和急性敗血癥等。由于大腸桿菌的血清型復(fù)雜,給免疫防治帶來(lái)一定的困難,因此,藥物防治是目前控制該病的主要手段,但在臨床治療和實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中濫用抗生素,導(dǎo)致耐藥大腸桿菌的大量出現(xiàn),不僅造成抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的治療失敗,而且其耐藥基因可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,使人體腸道菌產(chǎn)生相應(yīng)的耐藥性,對(duì)人類的健康安全構(gòu)成威脅。本試驗(yàn)檢測(cè)了山東部分地區(qū)113株鴨源大腸桿菌對(duì)15種常用抗菌藥物的敏感性,并對(duì)其耐藥性及耐藥譜進(jìn)行分析,為獸醫(yī)臨床正確選擇藥物治療鴨大腸桿菌病提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 113株大腸桿菌為2012年9月-2013年8月自青島、煙臺(tái)、濰坊、濟(jì)南等8個(gè)規(guī)模化養(yǎng)鴨場(chǎng)病鴨中分離。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)株,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 藥品與試劑 藥敏紙片(頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、加替沙星、左旋氧氟沙星、氨芐西林、克林霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、亞胺培南),均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基,均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.4 大腸桿菌的分離鑒定 無(wú)菌采集病死鴨的心臟、肝臟等病料,接種于2 mL LB肉湯中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液接種于麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)20 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取典型的菌落染色、鏡檢,純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定,三糖鐵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、M.R.、V-P、麥芽糖、葡萄糖、乳糖等發(fā)酵試驗(yàn),確定為大腸桿菌者保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥敏試驗(yàn) 將測(cè)試菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,于35℃恒溫培養(yǎng)16～24 h,挑取3～4個(gè)單菌落,用4 mL生理鹽水配成0.5 Mcfarland(麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn))的菌懸液,用無(wú)菌棉簽接種至4個(gè)MH瓊脂平板上,每個(gè)平板放置3～4個(gè)藥敏紙片,37℃培養(yǎng)20 h,測(cè)量抑菌圈直徑,每次試驗(yàn)時(shí),保證質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)。

1.6 耐藥分析 試驗(yàn)方法參考世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的Kirby-Bauer法,藥敏結(jié)果判定按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)的標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感、中介或耐藥。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定從采集的150份病鴨心臟、肝臟病料中,分離鑒定出113株細(xì)菌,經(jīng)生化試驗(yàn)結(jié)果分析,均符合大腸桿菌的特征,證明此113株分離菌是大腸桿菌,其分離率為75.3%。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 菌株對(duì)15種抗菌藥的耐藥情況 113株鴨源大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。復(fù)方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、氨芐西林、左旋氧氟沙星、阿米卡星、氯霉素、環(huán)丙沙星10種抗菌藥物的耐藥率高于50%,而復(fù)方新諾明的耐藥率達(dá)到了100%;耐藥率低于20%的抗菌藥物有亞胺培南、頭孢噻呋和加替沙星3種。113株鴨源大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的敏感性也有所不同,其中亞胺培南、頭孢噻呋、加替沙星、頭孢噻肟4種的敏感率高于50%。

2.2.2 大腸桿菌的多重耐藥 113株鴨源大腸桿菌表現(xiàn)出不同程度的耐藥且至少對(duì)1種抗菌藥表現(xiàn)出耐藥,同時(shí)耐14種抗菌藥物的菌株已達(dá)2.67%。同時(shí)對(duì)3種或以上藥物表現(xiàn)出耐藥的菌株占92.92%,其中同時(shí)耐12種藥物的菌株所占比例最大,為16.81%,其次是耐7種藥物的菌株為12.39%。細(xì)菌多重耐藥情況詳見圖1。

2.2.3 大腸桿菌的耐藥譜 鴨源大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥譜有56種,最普遍的耐藥譜型是復(fù)方新諾明-四環(huán)素-紅霉素-克林霉素-慶大霉素-氨芐西林-左旋氧氟沙星-阿米卡星-氯霉素-環(huán)丙沙星。

圖1 113株鴨源大腸桿菌多重耐藥性情況

表1 113株鴨源大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 鴨源大腸桿菌的耐藥情況 本試驗(yàn)分析了從山東地區(qū)分離的113株鴨源大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的敏感性,結(jié)果顯示,分離菌對(duì)四環(huán)素類和磺胺類藥物的耐藥率最高,其中對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率達(dá)到100%,對(duì)四環(huán)素的耐藥率達(dá)到93%。參考養(yǎng)殖場(chǎng)臨床用藥情況,這兩種藥物作為常用藥物使用,大腸桿菌在藥物長(zhǎng)期選擇壓力作用下,產(chǎn)生了耐藥性,導(dǎo)致這兩種藥物已基本失去了臨床治療價(jià)值。

試驗(yàn)顯示,亞胺培南是最敏感的藥物,但與2009年張珍珍[1]的報(bào)道相比,豬源大腸桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥率高達(dá)55.65%,說(shuō)明不同動(dòng)物間的耐藥率存在很大差異。但亞胺培南不能作為獸藥使用,所以應(yīng)該選擇頭孢噻呋作為有效的治療藥物。氯霉素因?qū)撬柙煅獧C(jī)能有抑制作用,現(xiàn)已被禁用于食品動(dòng)物,與劉吉山[2]報(bào)道的相比,分離株對(duì)氯霉素的敏感率由2005年報(bào)道的17%升到26%,提示在終止使用抗生素一定時(shí)間之后,細(xì)菌可能恢復(fù)其對(duì)藥物的敏感性。

氟喹諾酮類藥物作為一種廣譜抗菌藥物,其耐藥率也在逐年升高[3],第一代氟喹諾酮類藥物萘啶酸已基本失去臨床治療價(jià)值;第三代的氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率已經(jīng)達(dá)到了50%以上,結(jié)果與劉建華[4]的研究相符;但與朱恒乾的研究有一定差距,說(shuō)明不同地區(qū)的用藥也存在一定的差異,第四代加替沙星的耐藥率僅為 19.4%,敏感率高達(dá) 56.6%。

3.2 分離菌的多重耐藥 試驗(yàn)結(jié)果顯示,所分離的113株鴨源大腸桿菌均有不同程度的耐藥,且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。部分菌株對(duì)多達(dá)14種藥物耐藥,且菌株中以同時(shí)耐12種、7種、6種、9種和11種藥物的耐藥菌居多,同時(shí)耐3種或3種以上藥物的菌株占總分離株的92.92%,參考央珍[5]報(bào)道的重慶鴨源大腸桿菌耐3種或3種以上藥物的菌株達(dá)到100%、于學(xué)輝[6]報(bào)道的92.3%相一致,說(shuō)明大腸桿菌多重耐藥問(wèn)題在全國(guó)范圍內(nèi)都很嚴(yán)重。

交叉耐藥性現(xiàn)象提示在獸醫(yī)臨床用藥時(shí),應(yīng)先進(jìn)行細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn),再進(jìn)行選擇,以避免同一種或幾種藥物長(zhǎng)期使用,影響臨床治療效果及產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[7]。需要引起重視的是,對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的大腸桿菌,對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素和克林霉素等的耐藥率均在65%以上,說(shuō)明鴨源大腸桿菌不僅對(duì)同類藥物存在交叉耐藥,而且對(duì)其他種類的抗菌藥物也有嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象,這對(duì)鴨源大腸桿菌病的藥物治療提出了新的挑戰(zhàn)。

據(jù)報(bào)道,大腸桿菌很多耐藥基因位于質(zhì)粒上,而細(xì)菌的耐藥性可以通過(guò)質(zhì)粒水平傳播到其他細(xì)菌,甚至可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,將內(nèi)源耐藥菌群的耐藥基因擴(kuò)散到環(huán)境,對(duì)人體健康造成很大威脅[8]。雖然一般認(rèn)為質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制屬于低水平的,但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),這種低水平的耐藥性可使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到出現(xiàn)突變所需的濃度,從而出現(xiàn)高度耐藥,會(huì)對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,對(duì)人的健康會(huì)產(chǎn)生無(wú)可估量的影響[9]。因此加強(qiáng)對(duì)病原菌的耐藥性檢測(cè)刻不容緩。

本試驗(yàn)監(jiān)測(cè)的鴨源大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥水平普遍較高,總體耐藥情況不容樂(lè)觀,歸結(jié)原因主要是臨床用藥不規(guī)范引起的,其結(jié)果能夠反映山東部分地區(qū)臨床用藥情況?？咕幬锬退幮缘谋O(jiān)測(cè)為鴨場(chǎng)臨床用藥提供了依據(jù),對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥,減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義。為了延長(zhǎng)抗菌藥物的使用周期,更好地控制疾病的發(fā)生,應(yīng)合理的使用抗菌藥物,對(duì)癥下藥,定期進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn),輪換使用抗菌藥物等。

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