馬 良,許 磊,李曉冉

(1.中牧實業(yè)股份有限公司,北京 豐臺 100070;2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點實驗室,北京 海淀 100095)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起豬的一種急性傳染病,臨床表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙,保育豬呼吸道癥狀,哺乳仔豬發(fā)熱、神經(jīng)癥狀等。PCR方法是豬偽狂犬病病原診斷的重要技術(shù)手段,通常采用國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù)》中PCR方法。然而,國家標(biāo)準(zhǔn)方法僅針對gD基因進(jìn)行擴增,未考慮gE基因缺失活疫苗免疫動物后攜帶疫苗毒的問題,從而難以判斷動物是否因野毒感染而發(fā)病。為此,在偽狂犬病基因缺失活疫苗廣泛免疫的情況下,偽狂犬病病原檢測需要充分考慮疫苗gE基因缺失的情況,是部分缺失(如HB2000株),還是完全缺失(如Bartha-K61株),據(jù)此設(shè)計合適引物加以鑒別。本研究目的即是建立一種可以有效鑒別不同疫苗毒株和野毒的方法,為豬偽狂犬病野毒感染檢測提供可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒及疫苗 豬偽狂犬病病毒Ea株(PRVEa,經(jīng)典株)、豬偽狂犬病病毒HNzy2014株(PRVHNzy2014,流行毒株)、豬瘟病毒C株(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬細(xì)小病病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、由本實驗保存,豬偽狂犬病病毒活疫苗(Bartha-K61株),豬偽狂犬病耐熱保護劑活疫苗(HB2000株),購買于市場。

1.2 生化試劑 病毒核酸提取試劑盒EasyPure?Viral DNA/TNA kit、反轉(zhuǎn)錄試劑 TransScript?First-Stand cDNA kit、PCR試劑EasyTaq?PCR SuperMix等試劑,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 偽狂犬病野毒檢測 根據(jù)NCBI發(fā)表參考毒株序列及疫苗株基因序列,選擇豬偽狂犬病疫苗毒株gE缺失區(qū)域設(shè)計引物1對,上游引物gE1:5′-GACCATGCGGCCCTTTCTGCT-3′,下游引物 gE2:5′-GCCCTCGGACACGTTCACCAG-3′。 PCR 反應(yīng)體系為:2 × EasyTaq?PCR SuperMix 25 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1μL,DNA/cDNA 1 μL,加純水至50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min,94℃30 s,65℃ 30 s,72℃30 s,72℃5 min,步驟2至步驟4循環(huán)30次,PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察,PRV野毒陽性樣本應(yīng)出現(xiàn)277 bp大小的核酸條帶。

1.4 鑒別檢驗 選取 PRV-Ea、PRV-HNzy 2 014、Bartha-K61、HB2 000等4個偽狂犬病毒株,提取病毒核酸,分別采用1.3所述的偽狂犬病野毒gE-PCR和GB/T 18 641-2 002兩種方法進(jìn)行檢測,比較兩種方法對野毒和疫苗毒的鑒別檢測能力。

1.5 特異性試驗 選擇豬的常見病毒性傳染病病原提取DNA或cDNA,采用1.3所述方法進(jìn)行PCR檢測,確定方法的特異性。 CSFV、PRRSV、JEV、TGEV、PEDV等病毒提取RNA,采用TransScript?First-Stand cDNA kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得病毒cDNA,PPV、PCV-2、PRV等病毒提取DNA,作為PCR反應(yīng)的模板。

1.6 敏感性試驗 構(gòu)建含有g(shù)E目標(biāo)片段的T克隆載體,提取純化質(zhì)粒,采用NanoVue Plus超微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度,換算為拷貝數(shù),以TE溶液稀釋成101～108個拷貝,采用1.3的PCR方法進(jìn)行檢測,以出現(xiàn)陽性條帶最低拷貝數(shù)作為方法的最低檢測限。

1.7 組織樣品檢測 PRV-HNzy2014野毒感染豬、豬偽狂犬耐熱保護劑活疫苗(HB2000株)接種豬各5頭,接種后5 d,采集腦組織和肺組織,按照1∶10比例與PBS混合,研磨勻漿,6 000 r/min離心10 min,收集上清,采用EasyPure?Viral DNA/RNA kit提取DNA,按照1.3所述方法檢測病原核酸。

2 結(jié)果

2.1 鑒別檢驗 分別采用1.3所屬的偽狂犬病野毒gE-PCR檢測方法和GB/T 18641-2002方法進(jìn)行4種偽狂犬病病毒的檢測,其中建立的野毒檢測方法僅能擴增出經(jīng)典和流行PRV野毒,對Bartha-K61、HB2000、疫苗株擴增為陰性,說明該方法可以有效區(qū)分疫苗毒和野毒,而GB/T 18 641-2 002方法無法實現(xiàn)野毒和疫苗毒的鑒別(見圖1、圖2)。

圖1 GB/T 18 641-2 002引物鑒別檢驗

圖2 gE引物鑒別檢驗

2.2 特異性試驗 以 CSFV、PRRSV、JEV、TGEV、PEDV病毒cDNA,PPV、PCV-2病毒DNA為模板,經(jīng)偽狂病犬野毒gE-PCR檢測方法檢測均無目的條帶,僅PRV-Ea可以擴增出大小為277 bp的目標(biāo)條帶(見圖3),說明本方法檢測其他常見豬源病毒為陰性,特異性較好。

圖3 特異性檢驗

2.3 敏感性試驗 構(gòu)建了含有目標(biāo)gE片段的T克隆質(zhì)粒,初始濃度為101 μg/mL,相當(dāng)于2.2×1010個拷貝/μL。以 TE溶液稀釋成10～108個拷貝/μL,采用偽狂犬病野毒gE-PCR檢測進(jìn)行檢測,結(jié)果高于等于103個拷貝的核酸可以擴增出陽性條帶,低于10～102拷貝數(shù)核酸未能檢出,因此方法的最低檢測限為103個拷貝。

圖4 敏感性檢驗

2.4 組織樣品檢測 采用偽狂犬病野毒gE-PCR檢測方法,分別對PRV HNzy2014野毒感染豬和偽狂犬病gE基因缺失疫苗免疫豬的肺臟和腦組織混合液進(jìn)行檢測,結(jié)果野毒感染動物組織為核酸檢測陽性,而疫苗接種動物為陰性,說明建立的方法可以較好的進(jìn)行組織樣品的檢測(見圖5)。

圖5 PRV野毒感染及疫苗免疫動物組織樣品檢測

3 討論

豬偽狂犬病的診斷標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18 641-2002,自頒布以來沿用至今,由于其無法區(qū)分疫苗毒和野毒,造成檢測結(jié)果存在爭議。近年來,針對偽狂犬病毒gE基因的野毒檢測方法已有文獻(xiàn)[1-2]和公開專利報道[3-7],但由于豬偽狂犬病病毒富含GC核苷酸,引物設(shè)計較為困難,多數(shù)研究者將引物設(shè)計在gE中、后段,對部分gE前段缺失的疫苗(如HB 2000株)理論上依然能擴增出條帶,造成假陽性結(jié)果,引起不必要的爭端。

Bartha-K61是一株免疫原性良好的自然缺失疫苗株,應(yīng)用較為廣泛,缺失部分gI和全部gE基因,而毒力基因TK未缺失,具有一定的毒力。HB 2000株疫苗是新一代人工缺失的偽狂犬病缺失疫苗,缺失毒力TK基因,安全性較高,其gI基因的322～1 101位和gE基因的1～362位堿基存在缺失,由于其gE基因起始密碼子和啟動子的缺失,不會表達(dá)gE蛋白,因此接種動物血清gE抗體為陰性,可以實現(xiàn)與野毒感染動物血清學(xué)上的鑒別檢驗。本研究充分考慮了兩個疫苗毒株的缺失特點,在gI中后段和gE前段設(shè)計引物,篩選出一對較為理想的引物,上游引物位于gE基因起始密碼子附近,下游引物設(shè)位于gE基因上段253-273 bp位置,并建立PCR檢測方法。試驗表明,該方法特異性好,敏感性較高。特別值得關(guān)注的是,建立的PCR方法,所用試劑不需要添加額外GC Enhancer、DMSO等輔助試劑,即可有效擴增,同時采用了商品化含有核酸染料的PCRmix,簡化了操作步驟。另外,針對人工感染動物進(jìn)行了肺臟和腦組織的檢測,結(jié)果感染動物均檢出陽性結(jié)果,未出現(xiàn)組織核酸的非特異擴增干擾雜帶,因此該方法適合于進(jìn)行組織樣品豬偽狂犬病病原野毒的檢測,有一定的推廣應(yīng)用價值。

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