陳有旺,徐景華,馬玉忠

(1.廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)系,河北 廊坊 065001;2.山東省蘭陵縣新興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,山東 蘭陵 277732;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛的常見病,可使奶牛繁殖性能降低,泌乳量減少,它不僅影響著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,治療方法仍以西藥為主,由于該病的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,療效并不理想。大腸桿菌等革蘭陰性菌是奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌,細(xì)菌脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分[1]。姜黃素作為一種具有抗氧化、抗炎的中藥,在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景[2]。藥物進(jìn)入奶牛機(jī)體后要進(jìn)行藥物代謝,而細(xì)胞色素酶P450(CYP450)是藥物代謝的主要酶系[3]。本試驗(yàn)通過LPS制備奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞模型,姜黃素的處理,CYP450的表達(dá),篩選姜黃素的最佳作用劑量,為子宮內(nèi)膜炎的中藥防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 姜黃素,購自河北源創(chuàng)生物科技有限公司;LPS、DMEM/F-12,購自 Sigma公司;DHank’s、膠原酶Ⅰ,購自 Invitrogen 公司;FBS,購自浙江杭州四季青公司;兔抗牛CYP450一抗,購自上海安研商貿(mào)有限公司;堿磷酶標(biāo)記羊抗兔IgG,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;NBT、BCIP,購自Amresco公司;TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒,購自上?？祈樕锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌條件下采取奶牛的部分子宮,放入D-Hank’s液中漂洗。刮取子宮內(nèi)膜,轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的三角瓶中,加入1 g/L膠原酶Ⅰ,37℃水浴消化10 min。濾液1 000 r/min離心10 min,棄上清,Hank’s液洗3次。最后用含15%FBS的DMEM/F-12制成細(xì)胞懸液,放入培養(yǎng)瓶中,37℃/5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞模型的制備 將奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,用不同濃度的LPS處理,37℃/5%CO2條件下培養(yǎng)48 h,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,孵育 4 h。 吸去培養(yǎng)液,每孔加入 DMSO 100 μL,計(jì)算藥物對細(xì)胞的抑制率(IR≤10%),確定LPS的最佳作用濃度。用這一LPS濃度,作用子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h及48 h,雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測IL-l β和TNF-α的濃度。

抑制率=(對照組吸光度—實(shí)驗(yàn)組吸光度)/對照組吸光度×100%

1.4 姜黃素處理炎癥細(xì)胞,Western Blot法檢測CYP450的表達(dá) 不同濃度的姜黃素處理奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞24 h、48 h,收集蛋白,12%SDS-PAGE膠電泳,半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶封閉2 h,加CYP450一抗4℃6-8 h,TBST洗膜,堿磷酶標(biāo)記IgG二抗2 h,TBST洗膜3次,NBT/BCIP顯色。

2 結(jié)果

2.1 LPS最佳誘導(dǎo)濃度的篩選 由表1可知,誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞損傷的LPS濃度,在100 ng/mL時(shí)抑制率最接近10%,因而這一劑量為誘導(dǎo)炎癥模型的最佳濃度。

表1 LPS對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的抑制作用_________________________________________(n=8)

2.2 100 ng/mL LPS對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞IL-lβ和TNF-α表達(dá)的影響 由表2可知,100 ng/mL LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h、48 h,IL-1β、TNF-α的含量均顯著高于對照組(P<0.01)。

表2 LPS對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞TNF-α和IL-1β含量的影響 (n=8)

2.3 姜黃素對奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞CYP450表達(dá)的影響 用 0、0.1、0.5、1、5、10 mg/mL 的姜黃素處理奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞,24 h時(shí)CYP450的表達(dá)未見明顯變化。48 h時(shí),隨姜黃素濃度的升高CYP450的表達(dá)呈升高的趨勢,但在姜黃素濃度為10 mg/mL時(shí),CYP450的表達(dá)減弱。說明處理48 h時(shí),5 mg/mL的姜黃素為最佳作用劑量,見圖1。

圖1 姜黃素對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)的影響

3 討論

3.1 LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞模型的建立

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分[1],是引起炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì),可引起IL-1β、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的釋放。IL-1β和TNF-α在炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)中起著重要的作用[5]。本試驗(yàn)通過不同濃度的LPS作用于奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)100 ng/mL LPS既不干擾細(xì)胞的生長,又使細(xì)胞的抑制率接近10%。發(fā)現(xiàn)100 ng/mL LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h、48 h后,IL-1β、TNF-α的含量均顯著高于對照組(P<0.01),說明用100 ng/mL LPS誘導(dǎo),成功地制備了奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞模型,這為后續(xù)的試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

3.2 姜黃素對奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞CYP450表達(dá)的影響 姜黃素作為一種抗炎物質(zhì)[2],作用于奶牛子宮內(nèi)膜炎癥細(xì)胞24 h后,CYP450的表達(dá)沒有發(fā)生變化,說明作用時(shí)間較短,沒有引起CYP450表達(dá)的變化。作用48 h后,隨著姜黃素濃度的增加,CYP450的表達(dá)逐漸增強(qiáng),說明姜黃素作用時(shí)間長時(shí),才對CYP450產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。當(dāng)姜黃素濃度為10 mg/mL時(shí),CYP450的表達(dá)減弱,說明姜黃素濃度過高后,會(huì)造成細(xì)胞的損傷乃至死亡,CYP450表達(dá)因而下降。姜黃素作用細(xì)胞48 h,5 mg/mL的濃度為最佳劑量,這為下一步姜黃素合理地應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] Amini A M,Spencer J P E,Yaqoob P.Effects of pelargonidin-3-O-glucoside and its metabolites on lipopolysaccharide-stimulated cytokine production by THP-1 monocytes and macrophages[J].Cytokine,2018,103:29-33.

[2] 楊泰,王慧,田科雄,等.姜黃素的生理功能及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2017,29(10):3 460-3 466.

[3] Wei K,Chen H.Global identification,structural analysis and expression characterization of cytochrome P450 monooxygenase superfamily in rice[J].BMC Genomics,2018,19(1):35.

[5] 楊威,鄭麗,馬玉忠.姜黃素對子宮內(nèi)膜炎奶牛免疫功能的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013,(1):121-122.