賴紅芳， 潘立衛(wèi)， 呂貴密， 黃秀香

(河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州 546300)

翠云草[Selaginellauncinata(Desv.)spring]別稱藍(lán)地柏、綠絨草，系蕨類卷柏科卷柏屬(Selaginella)植物，其味微苦、性寒，具有清熱利濕、解毒、消淤止血的功效[1]。翠云草中含有黃酮類、氨基酸、酚類、多糖等多種對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，其中的主要成分穗花杉雙黃酮(amentoflavone)具有較好的抗腫瘤和抗病毒作用[2-3]，且無顯著毒性，抗衰老、抗氧化性強(qiáng)，還有抗炎、抗菌[4]、血管舒張等生理活性，是極好的天然抗氧化劑，有良好的保健作用，應(yīng)用前景極為廣闊。有學(xué)者在研究DNA氧化損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮對(duì)其具有保護(hù)作用，因而穗花杉雙黃酮還可作為一種潛在的基因治療藥物[5]。

大孔吸附樹脂是近幾十年發(fā)展起來的一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)、人工合成的有機(jī)高分子新型分離材料[6]，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于有機(jī)溶劑及酸堿，不受低分子化合物、無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子的干擾，吸附成效好，容易再生，使用周期長，被廣泛用于分離純化天然產(chǎn)物[7]。近年來，我國在使用大孔樹脂對(duì)天然產(chǎn)物的分離、純化工作已十分普遍[8-9]。查閱文獻(xiàn)可知，關(guān)于利用大孔吸附樹脂分離純化翠云草中穗花杉雙黃酮的優(yōu)化工藝目前未見報(bào)道。本試驗(yàn)用靜態(tài)吸附-解吸法從8種大孔吸附樹脂中初選出3種，再利用動(dòng)態(tài)吸附-解吸的方法篩選出1種吸附-解吸效果最好的大孔樹脂，并優(yōu)化其工藝條件，目的在于得到較高純度的穗花杉雙黃酮，為開發(fā)以穗花杉雙黃酮為主的藥品及功能性食品提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2016—2017年在河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。翠云草購買于廣西玉林藥材市場，經(jīng)潘立衛(wèi)實(shí)驗(yàn)師鑒定為翠云草全草；穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-15012505，純度>99.5%)，成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇、95%乙醇、磷酸等均為分析純；大孔樹脂 AB-8、HPD600、D4020、DM130、NKA-9、HP20、HPD450、D101，鄭州華溢科技新材料股份有限公司；色譜純乙腈，美國天地有限公司。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(四元泵，VWD檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器)、Agilent 1260 series色譜工作站、Agilent 8453型紫外-可見分光光度計(jì)(美國安捷倫公司)；KQ2200DE超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；AUW220D型十萬分之一天平(日本島津公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；MilliporeD-Q3超純水機(jī)(美國密理博公司)；SHA-C型國華恒溫振蕩器(中外合資深圳天南海北有限公司)。

1.2 高效液相色譜分析

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kramasil C18；流動(dòng)相V乙腈∶V0.1%磷酸水溶液=40 ∶60；流速為0.6 mL/min；UV檢測波長為269 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品2.1 mg，置于干凈干燥的25 mL燒杯中，加入濃度為80%乙醇溶解，恒溫超聲5 min，待溶解完全后冷卻，容量瓶定容至50 mL，即可制得50 mL濃度為0.042 mg/mL的穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確移取上述穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于6個(gè)25 mL容量瓶中，用濃度為80%的乙醇定容至刻度線，搖勻后靜置。用0.45 μm的濾膜過濾后按“2.1.1”方法測不同濃度穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的峰面積(S)，以穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、穗花杉雙黃酮峰面積(S)為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品溶液的制備

將翠云草洗凈干燥后粉碎，過40目篩，料液比為 1 g ∶20 mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。在超聲提取功率為 80 W、溫度為60 ℃的提取條件下，超聲提取0.5 h。重復(fù)提取2次后合并濾液，得到翠云草總提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到浸膏，試驗(yàn)前用80%乙醇溶解即可得到樣品溶液。

1.4 大孔吸附樹脂的選擇

1.4.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn) 精確稱取預(yù)處理好的8種大孔吸附樹脂各1 g至150 mL干凈干燥的錐形瓶中，分別加入處理好的粗提取液25 mL(穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度為0.012 334 mg/mL)，用保鮮膜密封錐形瓶瓶口，并用橡皮筋固定，于25 ℃、120 r/min下恒溫恒速振蕩吸附24 h，抽濾得上清液，分別以“1.2.3”方法測定各上清液中的穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算各種型號(hào)樹脂的吸附率。砂芯漏斗抽濾上述吸附飽和的樹脂，除去樹脂表面殘留的溶液，再置于原來的錐形瓶中，準(zhǔn)確加入80%乙醇25 mL后，將錐形瓶放在恒溫恒速振蕩器中振蕩24 h，充分洗脫后過濾，得到濾液，測定洗脫后穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，并按照以下的計(jì)算公式對(duì)各種型號(hào)大孔吸附樹脂的靜態(tài)解吸率進(jìn)行計(jì)算。

吸附率=(C0-C1)/C0×100%；

解吸率=C2/(C0-C1)×100%；

富集回收率=吸附率×解吸率。

式中：C0為吸附前穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度；C1為吸附后穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度；C2為解吸附后穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.4.2 動(dòng)態(tài)吸附-解吸性能試驗(yàn) 取從靜態(tài)吸附中選擇好的3種大孔吸附樹脂各4 g，濕法裝柱，將質(zhì)量濃度為 0.023 74 mg/mL 的穗花杉雙黃酮樣液35 mL加于柱頂，以 0.5 mL/min 的流速進(jìn)行吸附，吸附完全后，用蒸餾水以同樣的流速進(jìn)行清洗，清洗至流出液沒有顏色，收集過柱液和洗脫液。用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇以0.5 mL/min的速度洗脫至流出液沒有顏色，按“1.2.3”方法測定并計(jì)算大孔樹脂的吸附率和解吸率。

1.5 大孔吸附樹脂純化工藝的優(yōu)選

1.5.1 樣品溶液質(zhì)量濃度的考察 精確稱取4份經(jīng)過處理的NKA-9大孔吸附樹脂各4 g，裝入玻璃柱中。取質(zhì)量濃度分別為0.005 876、0.019 73、0.022 35、0.033 24 mg/mL的上樣液35 mL加于各柱頂，以相同的流速通過柱內(nèi)的大孔樹脂，待完全吸附后，測定吸附后樣液的穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算各項(xiàng)NKA-9型樹脂的吸附率。

1.5.2 樣品溶液不同流速對(duì)吸附率的影響 精確稱取4份經(jīng)過處理的NKA-9大孔吸附樹脂各4 g，裝入玻璃柱中。選取穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度為0.033 24 mg/mL的上樣液 35 mL 加于柱頂，以不同的流速通過樹脂柱，分別收集流出液，測定流出液穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。

1.5.3 泄露曲線的考察 精確稱取經(jīng)過處理的NKA-9大孔吸附樹脂4 g，濕法裝柱，選取穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度為 0.033 24 mg/mL 的樣品溶液70 mL進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附考察。樣品通過樹脂柱的速度為0.3 mL/min，分段收集流出液，每份 5 mL，收集14份，測定流出液中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.5.4 洗脫劑濃度的考察 精確稱取處理好的NKA-9大孔吸附樹脂各4 g，取穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度為 0.033 24 mg/mL 的樣液35 mL，以1 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全后，各個(gè)樹脂柱以相同的流速用10 mL蒸餾水沖洗，收集流出液和水洗液，分別用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集并測定這5份洗脫液的穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算其解吸率。

1.5.5 洗脫劑流速的考察 精確稱取4份經(jīng)過處理的NKA-9大孔吸附樹脂各4 g，裝入玻璃柱中。取35 mL質(zhì)量濃度為0.033 24 mg/mL的翠云草穗花杉雙黃酮樣液分別加于柱頂，以0.3 mL/min的速度通過樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全后，用10 mL的蒸餾水沖洗，合并流出液和水洗液，移取 35 mL 90%乙醇加于各個(gè)吸附后的樹脂柱，分別以不同流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定其洗脫液中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

1.5.6 洗脫劑用量的考察 精確稱取處理好的1份NKA-9大孔吸附樹脂4.0 g，濕法裝柱，移取35 mL質(zhì)量濃度為 0.332 4 mg/mL 穗花杉雙黃酮的樣品溶液進(jìn)行吸附，吸附完全后用10 mL蒸餾水沖洗，合并流出液和水洗液，用90%乙醇以0.3 mL/min的體積流量進(jìn)行解吸試驗(yàn)，加于柱頂?shù)?0%乙醇為70 mL，每5 mL解吸液收集1份并測定其質(zhì)量濃度，以收集到的份數(shù)作為橫坐標(biāo)、每份解吸液穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度作為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

精確稱取3份處理好的大孔吸附樹脂4.0 g，分別裝柱，按照優(yōu)選出各項(xiàng)純化工藝條件進(jìn)行平行試驗(yàn)，收集吸附后的流出液、水洗液、洗脫液，測定并計(jì)算吸附率、解吸率。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗花杉雙黃酮的測定方法

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 在色譜柱為Kramasil C18、流動(dòng)相V乙腈∶V0.1%磷酸水溶液=40 ∶60、流速為 0.6 mL/min、UV檢測波長為269 nm、柱溫為30 ℃、進(jìn)樣量為10 μL的條件下，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的出峰時(shí)間為5.8 min，穗花杉雙黃酮與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3 000(圖1)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按“1.2.3”操作后測不同濃度穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的峰面積(S)，以穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、穗花杉雙黃酮峰面積(S)為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=88 520x-5.271 4，r=0.999 7。

2.2 大孔吸附樹脂的選擇

2.2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn) 以吸附率和解吸率為主要參考因素，結(jié)合穗花杉雙黃酮回收率，由表1的數(shù)據(jù)對(duì)比可選擇出NKA-9、HP20、HPD450，用這3種大孔吸附樹脂進(jìn)行下一步的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

表1大孔吸附樹脂對(duì)穗花杉雙黃酮的靜態(tài)吸附與解吸附性能

2.2.2 動(dòng)態(tài)吸附-解吸性能試驗(yàn) 取處理好的HP20、NKA-9、HPD450大孔吸附樹脂各4 g，按“1.4.2”節(jié)操作后測定并計(jì)算NKA-9、HP20及HPD450大孔樹脂的吸附率和解吸率，結(jié)果見表2。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，NKA-9的吸附和解吸效果比HP20和HPD450好，所以選擇使用NKA-9大孔吸附樹脂進(jìn)行純化條件的優(yōu)選。

表22種大孔吸附樹脂對(duì)穗花杉雙黃酮的動(dòng)態(tài)吸附和解吸附性能

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝的優(yōu)選

2.3.1 樣品溶液質(zhì)量濃度的考察 取按“1.3”節(jié)制備得到的浸膏適量，用80%乙醇配成質(zhì)量濃度分別為0.005 876、0.019 73、0.022 35、0.033 24 mg/mL的上樣液35 mL按“1.5.1”節(jié)操作后計(jì)算各項(xiàng)NKA-9型樹脂的吸附率(表3)。

表3翠云草中穗花杉雙黃酮不同質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

當(dāng)上樣液中穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度為0.033 24 mg/mL時(shí)，吸附率較好。上樣液濃度過低，大孔樹脂沒有得到充分吸收，會(huì)降低大孔樹脂的吸附率；濃度高，吸附效果較好，但濃度為0.332 4 mg/mL時(shí)已是飽和質(zhì)量濃度，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮就呈現(xiàn)膏狀，所以0.033 24 mg/mL為最佳上樣濃度。

2.3.2 樣品溶液不同流速對(duì)吸附率的影響 按“1.5.2”節(jié)操作后以不同的流速即0.2、0.3、0.5、1.0 mL/min通過樹脂柱，分別收集流出液，測定流出液穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率，結(jié)果見表4。

表4翠云草中穗花杉雙黃酮不同流速對(duì)吸附率的影響

樣品溶液的流出速度越大，穗花杉雙黃酮沒被吸附就泄露了，導(dǎo)致吸附率越低。當(dāng)樣品溶液的流出速度為 0.2 mg/mL 時(shí)，吸附率最高，但速度過慢，耗時(shí)較長。所以選擇流出速度0.3 mL/min，這樣既保證了較快的進(jìn)度，又能得到較好的吸附率。

2.3.3 泄露曲線的考察 按“1.5.3”節(jié)操作后分段收集流出液，每份5 mL，收集14份，測定14份流出液中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度(圖2)。當(dāng)收集到第2個(gè)5 mL時(shí)，黃酮溶液開始泄露，當(dāng)收集到第7個(gè)5 mL時(shí)，流出的穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度基本達(dá)到峰值且不再有太大變化，說明當(dāng)質(zhì)量濃度為0.033 24 mg/mL的穗花杉雙黃酮樣品溶液為35 mL時(shí)，基本達(dá)到飽和狀態(tài)，因此建議上樣量為35 mL。

2.3.4 洗脫劑濃度的考察 按“1.5.4”節(jié)操作后分別用60%、70%、80%、90%、無水乙醇進(jìn)行洗脫，收集并測定這5份洗脫液的穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算其解吸率，結(jié)果見表5。

表5不同濃度洗脫劑對(duì)解吸率的影響

用90%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)解吸率最高，說明過低或過高的乙醇濃度都會(huì)對(duì)解吸率有影響。

2.3.5 洗脫劑流速的考察 按“1.5.5”節(jié)操作后分別以0.2、0.5、1.0、2.0 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定其洗脫液中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率(表6)。

表6不同洗脫流速對(duì)穗花杉雙黃酮解吸率的影響

由表6可知，洗脫速度越大，解吸率越低，因?yàn)榱魉俑呤沟孟疵撘号c吸附樹脂的接觸時(shí)間減少，物質(zhì)吸附-解析不充分。當(dāng)洗脫速度為0.2 mL/min時(shí)，解吸率最高，但是速度過慢，生產(chǎn)周期會(huì)延長，效率較低，故選0.5 mL/min為最佳洗脫流速。

2.3.6 洗脫劑用量的考察 按“1.5.6”節(jié)操作后用90%乙醇以0.3 mL/min的體積流量進(jìn)行解吸試驗(yàn)，加于柱頂?shù)?0%乙醇為70 mL，每5 mL解吸液收集1份并測定其質(zhì)量濃度，以收集到的份數(shù)作為橫坐標(biāo)、每份解吸液穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度作為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)洗脫液體積為35 mL時(shí)，穗花杉雙黃酮基本洗脫完全，因而選擇洗脫液體積為35 mL。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

精確稱取處理好的大孔吸附樹脂4.0 g，共3份，分別裝柱，按照各項(xiàng)優(yōu)選出的含穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度為 0.033 24 mg/mL 的翠云草樣品溶液35 mL，上柱，按上述各項(xiàng)純化工藝優(yōu)選進(jìn)行平行試驗(yàn)，收集吸附后的流出液、水洗液、洗脫液，測定并計(jì)算吸附率、解吸率，結(jié)果(表7)表明，該純化工藝重復(fù)性良好。

表7驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

將提取出來的穗花杉雙黃酮用NKA-9等8種大孔樹脂進(jìn)行純化，其中NKA-9、HP20和HPD450大孔樹脂的吸附率較好。穗花杉雙黃酮屬于極性稍大物質(zhì)，而NKA-9的極性相對(duì)較強(qiáng)，利用相似相容原理，穗花杉雙黃酮更容易被 NKA-9 吸附，所以其吸附率相對(duì)比其他樹脂要高。

通過靜態(tài)試驗(yàn)從8種大孔吸附樹脂中篩選出NKA-9、HP20和HPD450進(jìn)行動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，最終對(duì)NKA-9型大孔吸附樹脂進(jìn)行條件優(yōu)化，得到最佳純化條件：上樣液質(zhì)量濃度為0.033 24 mg/mL、上樣流速為0.3 mL/min、上樣體積為 35 mL，用90%的乙醇在洗脫流速為0.5 mL/min、用量為 35 mL 進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)結(jié)果表明，NKA-9大孔吸附樹脂對(duì)穗花杉雙黃酮的吸附-解吸附比較合適，分離純化效果較好，穗花杉雙黃酮的回收率達(dá)57.09%，NKA-9大孔吸附樹脂為穗花杉雙黃酮的純化生產(chǎn)提供了一種新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：2582-2583.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：210.

[3]范曉磊，徐嘉成，林幸華，等. 翠云草中雙黃酮類成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2009，44(1)：15-19.

[4]宋 慧，李 勇. 黃酮類化合物的保健作用[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2004，10(11)：45-47.

[5]王 力. 穗花雙黃酮對(duì)DNA氧化損傷的體外保護(hù)作用及其機(jī)理研究[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[6]婁 嵩，劉永峰，白清清，等. 大孔吸附樹脂的吸附機(jī)理[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2012，24(8)：1427-1436.

[7]劉 丹，吳葉紅，李瑋桓，等. 大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用[J]. 中草藥，2016，47(15)：2764-2770.

[8]丁揚(yáng)洲，馮少斌，崔 倩，等. 大孔樹脂純化過崗龍總多酚的工藝研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2017，28(9)：2103-2105.

[9]黃凱敏，楊海梅，覃春慮，等. 大孔吸附樹脂分離純化雞骨草總皂苷的工藝研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26(12)：2868-2869.