王 華

(河北環(huán)境工程學(xué)院，河北秦皇島 066102)

黃秋葵[Abelmoschusesculentus(L.)Moench]為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，目前在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)均有栽培，其資源較為豐富。黃秋葵嫩果特有黏性物質(zhì)，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類化合物等，且營(yíng)養(yǎng)豐富，黃秋葵還可作為菜、藥、花兼用，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和應(yīng)用前景[1-2]。目前對(duì)于黃秋葵功效研究，主要集中在其抑菌作用、抗氧化、抗疲勞、降血糖血脂、保健護(hù)胃等方面[3-6]。

自由基作為生命活動(dòng)的天然中間代謝產(chǎn)物，與生命體損傷、衰老和一些疾病密切相關(guān)。因此，天然抗氧化物質(zhì)清除自由基的能力已經(jīng)成為體外抗氧化活性研究的熱點(diǎn)[7-9]。已有利用黃秋葵水提物進(jìn)行抗疲勞與降血糖等相關(guān)研究[3-5]，但目前未見(jiàn)對(duì)黃秋葵水提物體外抗氧化作用的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究以黃秋葵嫩莢的水提物為基礎(chǔ)，通過(guò)2種不同干燥方法獲得黃秋葵水提物干品，進(jìn)行系統(tǒng)的體外抗氧化研究，以期為黃秋葵水提物的綜合利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵，購(gòu)自北京新發(fā)地農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。2，2′-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，Sigma；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，Sigma；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，Sigma；2，2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(簡(jiǎn)稱AAPH)，Sigma；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2802紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，UNICO公司；XH-C旋渦振蕩儀，金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-6000亞榮旋蒸蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，常州諾基儀器有限公司；EpochTM微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)伯騰儀器有限公司(BioTek)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司(Tecan Group Ltd)。

1.3 黃秋葵水提物的提取工藝

黃秋葵嫩莢→切片→自然晾干→加水浸泡(加熱攪拌)→過(guò)濾→濾液烘干→稱質(zhì)量。

黃秋葵水提物提取率計(jì)算公式：

水提物得率=(水提物質(zhì)量/黃秋葵鮮質(zhì)量)×100%。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 多糖和總糖測(cè)定方法

1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[10]配制0.2 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，各以水補(bǔ)至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，然后迅速加入5 mL濃硫酸，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測(cè)定吸光度，用2 mL水按同樣顯色操作作為空白對(duì)照，橫坐標(biāo)為多糖濃度(mg/mL)，縱坐標(biāo)為吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.1.2 黃秋葵多糖含量的測(cè)定 稱取1.00 g黃秋葵水提物，加入100 mL蒸餾水，超聲溶解，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置2 h，離心，烘干。

將黃秋葵粗多糖加入一定體積的蒸餾水中溶解，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，參照“1.4.1.1”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法進(jìn)行樣品中多糖含量的測(cè)定。

1.4.1.3 黃秋葵總糖含量的測(cè)定 稱取1 g黃秋葵水提物，加入100 mL蒸餾水，超聲溶解，定容至100 mL，取1 mL樣品，稀釋至100 mL，參照“1.4.1.1”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法進(jìn)行樣品中總糖含量的測(cè)定。

1.4.2 水分含量的測(cè)定 參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》。

1.4.3 灰分含量的測(cè)定 參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》。

1.4.4 果膠含量的測(cè)定 參照NY/T 2016—2011《水果及其制品中果膠含量的測(cè)定》。

1.5 抗氧化測(cè)定方法

1.5.1 ABTS+·清除能力 參考Li等的方法[11]，分別配制ABTS儲(chǔ)備液(7.4 mmol/L)、K2S2O8儲(chǔ)備液(2.6 mmol/L)、Trolox標(biāo)準(zhǔn)液(0.3 mmol/L)，以及不同濃度的黃秋葵水提物水溶液。取上述ABTS儲(chǔ)備液0.2 mL與K2S2O8儲(chǔ)備液 0.2 mL 混勻，于室溫黑暗處存放12 h，稀釋40～50倍即為ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取ABTS工作液0.8 mL和樣品0.2 mL，混勻，振蕩10 s，靜置 6 min。以蒸餾水作為空白對(duì)照，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)液作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+·清除率計(jì)算公式如下：

ABTS+·清除率=[D734 nm(0)-D734 nm]/D734 nm(0)×100%。

式中：D734 nm(0)為空白對(duì)照在734 nm處的吸光度。

1.5.2 DPPH自由基清除能力 參考Li等的方法[11]，取 1 mL DPPH乙醇溶液(0.05 mg/mL)，在519 nm處測(cè)吸光度(以1.2～1.3最佳)。取2 mL上述DPPH溶液加入試管中，加入1 mL不同濃度的樣品液，混合，靜置30 min，測(cè)D519 nm。以蒸餾水作為空白對(duì)照，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)液作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率=[D519 nm(0)-D519 nm]/D519 nm(0)×100%。

式中：D519 nm(0)為空白對(duì)照在519 nm處的吸光度。

1.5.3 ·OH清除能力[12]參考文鏡等的方法[12]，稍作改動(dòng)。清除羥自由基能力參照水楊酸捕捉羥自由基法測(cè)定。取9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸溶液各1 mL，加入不同濃度的樣品溶液1 mL與適量蒸餾水，最后加入 1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液后搖勻，37 ℃水浴加熱15 min，測(cè)其D593 nm?？瞻讓?duì)照溶液為去離子水，參比溶液為不加雙氧水的體系?！H清除率計(jì)算公式如下：

·OH清除率={D593 nm(0)-[D593 nm(x)-D593 nm(x0)]}/D593 nm(0)×100%。

式中：D593 nm(0)為空白對(duì)照在593 nm處的吸光度；D593 nm(x0)為空白參比溶液在593 nm處的吸光度；D593 nm(x)為樣品參比溶液在593 nm處的吸光度。

式中：ΔD325 nm(0)為空白對(duì)照時(shí)在300 s與0 s時(shí)于325 nm處吸光度的差值；ΔD325 nm(sample)為樣品在300 s與0 s時(shí)于 325 nm 處吸光度的差值。

1.5.5 鐵離子還原/抗氧化能力(ferricion reducing atioxidant power，簡(jiǎn)稱FRAP) 參考Benzie等的方法[13-14]，稍作修改。取0.3 mL樣品，加2.7 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm處測(cè)其吸光度，以蒸餾水為空白對(duì)照。根據(jù)所得D593 nm，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4濃度，定義為FRAP值(單位μmol/g，以Trolox計(jì))，其值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5.6 氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，簡(jiǎn)稱ORAC) 參考相關(guān)方法[15-16]，取熒光素鈉溶液(80 nmol/L)100 μL于96孔熒光板中，加入不同濃度樣品溶液50 μL振蕩5 min，37 ℃溫育10 min后迅速加入AAPH液(153 mmol/L)50 μL啟動(dòng)反應(yīng)，每隔2 min測(cè)定1次熒光值(記為Fn，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm)。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算ORAC值(單位μmol/g，以Trolox計(jì))。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵水提物的制備

將10 kg新鮮黃秋葵用自來(lái)水清洗后切片(5～10 mm)，自然晾干稱質(zhì)量得1.28 kg。取干品500 g，料液比 1 g ∶20 mL，95 ℃提取1 h，提取2次，過(guò)濾合并濾液，濃縮、干燥后得到173 g，黃秋葵水提物得率為4.43%。

2.2 水提物主要營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可以看出，凍干水提物中功能成分多糖含量高達(dá)12.01%，黃酮含量為1.10%，果膠含量為2.0%。在不同干燥條件下，除水分含量，水提物中功能成分含量沒(méi)明顯差異。

表1黃秋葵水提物各營(yíng)養(yǎng)成分(n=3)

2.3 抗氧化能力

2.3.1 ABTS+·清除能力 由圖1可見(jiàn)，當(dāng)黃秋葵水提物濃度≥0.5 mg/mL時(shí)，黃秋葵水提物的ABTS+·清除能力均高于79%，當(dāng)黃秋葵水提物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，黃秋葵水提物的ABTS+·清除能力下降了50%?？梢?jiàn)黃秋葵水提物的不同干燥方式對(duì)ABTS+·清除能力影響不明顯，烘干處理的EC50約為0.2 mg/mL。

2.3.2 DPPH·清除能力 如圖2所示，黃秋葵水提物經(jīng)烘干后，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最大值，黃秋葵烘干水提物的EC50約為2.3 mg/mL；而經(jīng)凍干的黃秋葵水提物其DPPH·清除率隨著濃度增大而增高，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到79.1%，黃秋葵凍干水提物的EC50約為0.1 mg/mL。

2.3.3 ·OH清除能力 如圖3所示，黃秋葵水提物干燥后，對(duì)·OH清除能力具有一定的濃度依賴關(guān)系，隨著濃度增大而增強(qiáng)，凍干處理黃秋葵水提物的EC50約為8.3 mg/mL。

2.3.5 其他抗氧化活性 參考Benzie等方法[13-14]，稍作修改。以FeSO4作為標(biāo)準(zhǔn)品，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.002 3x+0.319(r2=0.993)；以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.005 9x+0.030 8(r2=0.998)。根據(jù)回歸方程計(jì)算，烘干水提物與凍干水提物FRAP如表2所示。在測(cè)定水提物FRAP的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和濃度有一定量效關(guān)系，與李孟秋等的研究結(jié)果一致[9]。

參考相關(guān)方法[15-16]，以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.276 6x+15.311(r2=0.991)。根據(jù)回歸方程計(jì)算烘干水提物與凍干水提物的ORAC如表2所示，可見(jiàn)水提物總抗過(guò)氧化自由基能力ORAC高于常見(jiàn)蔬菜青花菜(總ORAC為168 μmol/g)。

表2黃秋葵水提物FRAP和ORAC(n=3)

3 結(jié)論

黃秋葵水提物經(jīng)熱風(fēng)烘干或冷凍干燥，在其體外抗氧化性研究中，不同干燥方法對(duì)體外抗氧化性有一定影響，干燥方法除對(duì)DPPH·清除率與ORAC有明顯影響外，對(duì)其抗氧化能力沒(méi)有明顯影響。在后續(xù)試驗(yàn)中，在選取FRAP的測(cè)定過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和濃度有一定量效關(guān)系，并且在模擬胃液和腸液代謝研究過(guò)程中具有不同的變化規(guī)律，這需要在今后進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

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