馬一方， 蘭 淼， 劉研萍， 李秀金

(北京化工大學 環(huán)境科學與工程， 北京 100029)

木質纖維素類是一種結構復雜、性質穩(wěn)定的可再生生物質資源，占生物質總量的40%～50%[1]。木質纖維素類的主要化學成分為纖維素(40%～50%)、半纖維素(25%～30%)和木質素(15%～20%)，這三種成分在共價鍵和非共價鍵的作用下構成植物細胞壁的基本骨架，形成天然的“生物質抗降解屏障”[2]。高效轉化木質纖維素類在當今資源緊缺的背景下具有重大意義。纖維素酶作為一種高效催化劑，可以將纖維素轉化為纖維二糖和葡萄糖等小分子的可溶性糖，實現(xiàn)纖維素的高效利用[3]。酶水解反應條件溫和，水解效率高。但是纖維素酶作為一種水溶性制劑，會與產物融合在一起，一方面導致產物的純度降低，另一方面造成纖維素酶的流失。同時纖維素酶對溫度和pH值等條件敏感。因此纖維素酶的循環(huán)多次利用和提高穩(wěn)定性是主要解決的兩個問題。劉路寬[4]等人采用介孔分子篩固定纖維素酶，固定率為31.5%，其pH值穩(wěn)定性、穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高。陳偉兵[5]以海藻酸鈉載體，以KH-550偶聯(lián)劑，固定化酶的米氏常數(shù)與游離酶相比增加了近3倍。米氏常數(shù)的增加表明酶分子其與底物的親和力降低。

本文采用海藻酸鈉-聚乙二醇固定纖維素酶，操作簡單、固定條件溫和、對環(huán)境友好。以相對酶活力和酶活固定率為指標對固定化條件進行優(yōu)化，并以相對酶活力為指標對優(yōu)化后的固定化酶的酶學性質進行研究，分析固化方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

纖維素酶購自源葉生物，產自綠色木霉，淡黃色粉末，酶活力為11 U·mg-1，4℃保存。海藻酸鈉購自國藥集團，化學純。聚乙二醇購自源葉生物，分子量4000，化學純。

1.2 實驗設計

1.2.1 固定化酶的制備及優(yōu)化

在3.5%(w/w)的海藻酸鈉溶液中加入聚乙二醇，混合均勻。取5 mL 3.5%(w/w)海藻酸鈉溶液與1 mL纖維素酶液混合均勻后，加入1% 戊二醛作為交聯(lián)劑，150 r·min-1振蕩30 min。4℃靜置交聯(lián)4 h。將上述交聯(lián)后的溶液通過5 mL注射器加入至2 %(w/w)CaCl2溶液中進行固定，形成凝膠小球。更換CaCl2溶液，于4℃下硬化2 h。用0.9%(w/w)NaCl溶液洗滌固定化酶以去除未被固定的游離酶，吸干表面水分，4℃保存。

以相對酶活力和酶活固定率為指標對酶液濃度、戊二醛用量、固定時間、固定溫度和聚乙二醇用量進行優(yōu)化。

1.2.2 固定化酶的酶學性質分析

以相對酶活力為指標，對上述優(yōu)化后所制備的固定化酶的最適pH值、最適溫度、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和米氏常數(shù)等酶學性質進行測定分析。

1.3 分析方法

還原糖，CMC-Na酶活：DNS法[6]。

酶活固定率按公式(1)計算[7]：

酶活固定率(%)=

(1)

2 結果與討論

2.2 海藻酸鈉固定化酶條件優(yōu)化

2.2.1 加酶量對固定化酶的效果影響

加酶量對固定化酶的效果影響見圖1。將最大酶活力設定為100%。加酶量由2.5 mg·mL-1增加至12.5 mg·mL-1，固定化酶的相對酶活力隨之增加，由53%增加至100%。隨著載體所固定的酶分子量的增加，二者之間的結合位點逐步接近飽和，因此當酶液濃度為10 mg·mL-1時，固定化酶的酶活力達到99%，進一步增加酶液濃度，酶活力增加不明顯。由于載體與酶分子之間的結合位點有限，因此盡管在固定體系中加大酶液濃度使得被固定的酶分子量增加，但是大部分酶分子會以游離態(tài)的形式損失掉[8]，因此酶活固定率隨著給酶量的增加而逐步降低，由69%降至25%。綜合考慮加酶量對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響，選擇酶液濃度為5.0 mg·mL-1用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖1 加酶量對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響

圖2 交聯(lián)劑用量對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響

2.2.2 交聯(lián)劑用量對固定化酶的效果影響

交聯(lián)劑用量對固定化酶的效果影響見圖2。將最大酶活力設定為100%。交聯(lián)劑采用1%(w/w)戊二醛。隨著戊二醛用量的增加，固定化酶的相對酶活力和酶活固定率的變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)出先增加而后降低的趨勢。戊二醛作為交聯(lián)劑，含有的兩個醛基官能團，可以與纖維素酶中的氨基發(fā)生Schiff交聯(lián)反應[9]。隨著戊二醛用量的增加，酶分子之間交聯(lián)度增加，在一定程度上可以減少由于酶分子粒徑過小而導致的酶流失，提高其固定率。但是當交聯(lián)劑的用量過大，會導致纖維素酶的交聯(lián)度過大，使得酶分子的活性中心受到破壞，酶活力降低。當在海藻酸鈉∶戊二醛(v∶v)大于1∶0.3時，固定化酶的相對酶活力和酶活固定率不再增加。因此選擇海藻酸鈉∶戊二醛(v∶v)為1∶0.3用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.2.3 固定化時間對固定化酶的效果影響

固定化時間對固定化酶的效果影響見圖3。將最大酶活力設定為100%。固定化酶的相對酶活力和酶活固定率隨固定化時間的變化趨勢一致，呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢。當固定化時間為2.5 h時，固定化酶的相對酶活力和酶活固定率均達到最大值。

固定化的過程是海藻酸鈉的α-L-古羅糖醛酸(G單元)的Na+與CaCl2的Ca2+由外在內發(fā)生離子交換反應的過程。G單元中的2-OH 和5-COOH通過配位鍵與Ca2+形成“egg-box”結構，生成凝膠將酶分子包埋固定[10]。隨著固定化時間的延長，離子交聯(lián)反應更為充分，載體結構更為致密，可以減少在固定過程中由于載體表面和內部的孔徑過大造成的酶分子流失。同時凝膠強度與Ca2+含量呈正相關，可以對酶分子的活性起到保護作用[11]。并且Ca2+也是纖維素酶的激活劑，可以提高纖維素酶的活力[12]。但是當固定化時間大于2.5 h后，隨著時間的進一步延長，載體表面的孔徑結構過于致密，在一定程度上會阻礙底物進入至載體內部與酶分子充分地接觸，傳質阻力增加，使得纖維素酶的酶活力降低。因此固定時間為2.5 h用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖3 固定化時間對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響

圖4 固定化溫度對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響

2.2.4 固定化溫度對固定化酶的效果影響

固定化溫度對固定化酶的效果影響見圖4。將最大酶活力設定為100%。隨著固定化溫度的增加，相對酶活力和酶活力均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。當固定化溫度為50℃時，相對酶活力和酶活固定率均達到最大值。隨著固定化溫度的增加，可以加速海藻酸鈉與CaCl2進行離子反應，在一定的固定化時間內，使載體的結構更為致密，提高酶分子的固定率。但是載體一旦過于致密，會增加底物的擴散系數(shù)，使得纖維素酶的酶活力降低。同時纖維素酶的活性與溫度有關，溫度過高會導致纖維素酶的活性中心位點受到影響，從而使酶分子的活力降低；當溫度高于50℃時，酶分子的失活率大于酶分子的固定率，在綜合作用下，使得纖維素酶的酶活力降低。因此選擇固定溫度為50℃用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.2.5 聚乙二醇用量對固定化酶的效果影響

聚乙二醇用量對固定化酶效果的影響見圖5。將最大酶活力設定為100%。固定化酶的相對酶活力和酶活固定率隨聚乙二醇用量的增加，二者均呈現(xiàn)為先增加后降低的變化趨勢。當海藻酸鈉∶聚乙二醇為1∶1.5(w∶w)時，固定化酶的相對酶活力和酶活固定率均達到最大值，并且與未添加聚乙二醇的固定化酶相比，添加聚乙二醇可以提高酶活力和酶活固定率分別為25%和18%。

圖5 聚乙二醇用量對固定化酶相對酶活力和酶活固定率的影響

聚乙二醇用作致孔劑的原理為其可以在海藻酸鈉與Ca2+交聯(lián)時從固定化體系中溶出，增加載體的孔密度。同時聚乙二醇含有的聚乙二醇基和羥基均可以與載體和酶分子形成氫鍵，增加固定化酶的親水性，提高酶活力[13]。隨著聚乙二醇用量的進一步提高，當海藻酸鈉∶聚乙二醇(w∶w)大于1∶1.5后，載體表面及內部的孔密度過大，會造成酶分子的流失，因此固定化酶的酶活力和酶活固定率均降低。

2.3 固定化酶與游離酶的酶學性質對比分析

2.3.1 pH值對固定化酶和游離酶酶活力的影響

pH值對固定化酶和游離酶酶活力的影響見6。將最大酶活力設定為100%。pH值會影響底物和酶分子的解離和絡合、影響纖維素酶的活性中心分子構象，從而影響酶分子穩(wěn)定性，因此過高或者過低的pH值會使纖維素酶的活性降低[14]。其中，游離酶的最佳pH值為4，固定化酶的最佳pH值為5，比游離酶的最佳pH值增加了一個單位。這種原因可能是由于海藻酸鈉在反應體系中具有大量的羧基官能團，可以與H+結合生成羧酸，載體周圍聚集大量的H+，使得反應體系較游離酶的反應體系相比向酸性移動，因此為了維持酶分子的最佳pH值使得固定化酶的表觀pH值向堿性方向移動。

圖6 pH值對游離酶和固定化酶酶活力的影響

圖7 溫度對游離酶和固定化酶酶活力的影響

2.3.2 溫度對固定化酶和游離酶酶活力的影響

溫度對固定化酶和游離酶酶活力的影響見圖7。將最大酶活力設定為100%。在溫度為30℃～80℃的變化范圍內，固定化酶和游離酶的酶活力均為先增加后降低的變化趨勢。原因是在酶催化反應過程中，升高反應體系的溫度，一方面可以提高底物和酶分子的分子動能，有助于加速二者的吸附、解離和絡合，改變反應的平衡常數(shù)從而加速酶促反應的進行；而另一方纖維素酶自身的活性位點會受到溫度的影響，其活性會隨著溫度的升高而降低甚至失活，最適溫度是兩方面綜合作用的結果[15]。

游離酶的最適溫度為50℃，固定化酶的最適溫度為70℃，與游離酶相比，固定化酶的最適溫度增加了20℃。因為纖維素酶經過交聯(lián)固定后，一方面酶分子運動和伸展受到限制，因此其活性中心的穩(wěn)定性增加，而另一方面，載體可以阻擋過高的溫度對酶分子的影響。

2.3.3 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性分析

固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性分析見圖8。將最大酶活力設定為100%。固定化酶和游離酶在30℃～80℃下保溫2 h，固定化酶和游離酶的酶活力有不同程度的降低。

當溫度低于40℃時，游離酶的活力沒有明顯變化，相對酶活力保持在100%，由40℃升高至60℃時，游離酶的相對酶活力迅速降至39%，進一步升高至80℃，相對酶活力變化不明顯，穩(wěn)定在33%以上。

當溫度低于60℃時，固定化酶的相對酶活力保持超過98%，酶活力沒有明顯的變化。當溫度高于60℃之后，固定化酶的酶活力降低較為明顯。因為纖維素酶經過交聯(lián)固定后，一方面酶分子的空間構型更為穩(wěn)定、活性中心得到保護，另一方面載體可以阻擋高溫等不利因素對酶分子的直接接觸，從而使固定化酶的熱穩(wěn)定性提高[16]。并且當溫度高于固定化酶和游離酶自身的最適溫度后，酶活力降低明顯?？赡苁且驗榈陀谧钸m溫度的保溫，溫度可以使酶分子提前預熱用于后續(xù)酶水解反應，溫度高于最適溫度后，保溫使得酶分子的活性位點和空間構型受到不可逆的影響，使其發(fā)生熱變性。

圖8 游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性分析

2.3.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性分析

固定化酶的操作穩(wěn)定性分析見表1。將最大酶活力設定為100%。在初次使用過后，會有部分未被載體完全固定的淺層游離態(tài)的酶分子流失，從而導致酶活力大幅度降低。并且在重復使用的過程中，反應體系的pH值和溫度等因素會對載體和酶分子的穩(wěn)定性造成影響，可能導致酶分子泄露以及酶活性降低[11]。

2.3.5 固定化酶和游離酶的Km對比分析

固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)Km擬合曲線圖9和圖10所示。固定化酶和游離酶的Km分別為1.850 mg·mL-1和0.809 mg·mL-1。較游離酶相比，固定化酶的Km增加了125%，說明固定化酶與底物之間的親和力降低。原因一方面是因為酶分子被固定在載體內部，與底物的接觸受限，降低了底物和酶分子之間的親和力；另一方面是纖維素酶經過交聯(lián)劑的交聯(lián)，空間構象和活性中心可能發(fā)生改變，導致Km增加[14]。

表1 固定化酶操作穩(wěn)定性分析 (%)

3 結論

(1)綜合考慮相對酶活力和酶活固定率，海藻酸鈉-聚乙二醇固定化酶的制備條件為∶酶液濃度=5 mg·mL-1，交聯(lián)劑采用1%(w/w)戊二醛，海藻酸鈉∶戊二醛=1∶0.3(v∶v)，海藻酸鈉∶聚乙二醇=1∶1.5(w∶w)，固定溫度和時間分別為50℃和2.5 h。

圖9 游離酶的Linear-Burk圖

圖10 固定化酶的Linear-Burk圖

(2)與游離酶相比，固定化酶的最適pH值向堿性方向移動，最適溫度提高20℃，熱穩(wěn)定性提高，米氏常數(shù)提高1倍。循環(huán)水解利用3次后，仍可保留50%的酶活力。說明此固定方法可以有效的將纖維素酶固定，并且酶學性質較游離酶大幅度提升。

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