李建華劉琴周亞平張泉鵬 張利坤施開平李春

（1，云南省安寧市畜牧獸醫(yī)站 650300；2，云南省昆明市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 650041）

牛結(jié)核病是由牛型分枝桿菌等引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病，我國列為二類疫病。根據(jù) 《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》，對其采取 “監(jiān)測、檢疫、撲殺、消毒和凈化”相結(jié)合的綜合性防治。檢疫方法以牛型PPD變態(tài)反應為主。據(jù)報道變態(tài)反應結(jié)果受奶牛健康狀況、環(huán)境因素的影響，非結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核感染，常造成假陽性結(jié)果。目前，新的檢測方法γ-干擾素雙夾心法ELISA法已被世界動物衛(wèi)生組織 （OIE）認可，并作為唯一的輔助診斷使用，在歐盟、美國、澳大利亞和新西蘭被批準為正式試驗。γ-干擾素ELISA原理是結(jié)核菌素PPD抗原刺激淋巴細胞后，感染牛結(jié)核分枝桿菌的細胞就能產(chǎn)生IFN-γ，并基于單克隆抗體的夾心ELISA檢測到。未感染牛結(jié)核分枝桿菌的淋巴細胞不會產(chǎn)生IFN-γ，因此，γ-干擾素的檢測與牛結(jié)核分枝桿菌感染相關(guān)。

本實驗通過比對單純頸部皮試變態(tài)反應 （SCT）、比較皮試變態(tài)反應 （CCT）與γ—干擾素釋放實驗 （IGRA）之間的差異，為臨床實際應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PPD與試劑盒

皮膚實驗用牛型PPD、禽型PPD、牛結(jié)核伽馬干擾素ELISA檢測試劑盒購自瑞士Prionics公司。

1.2 實驗用牛

為安寧市某奶牛養(yǎng)殖小區(qū)隨機挑取75頭奶牛，同時進行禽結(jié)核PPD、牛結(jié)核PPD皮內(nèi)變態(tài)反應，每頭牛分別注射牛型、禽型結(jié)核菌素0.1ml，72、96h觀察結(jié)果，計算皮厚差。SCT判定標準：皮厚差超過4mm判為陽性，2～4mm為可疑，小于2mm為陰性。

CCT判定標準：如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超過4mm判為陽性，1～4mm為可疑，小于或等于禽型PPD的皮厚差為陰性。

1.3 牛γ-干擾素實驗

采集奶牛頸靜脈血5ml，置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運送到實驗室，在采血后8h內(nèi)進行刺激培養(yǎng)。操作參照試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標準：牛型PPD OD值-PBS OD值≥0.1，且牛型PPD OD值—禽型PPD OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD OD值—PBS OD值＜0.1或牛型PPD OD值—禽型PPD OD值＜0.1判為陰性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SCT、CCT、IGRA3種方法陽性檢出率

75頭牛的檢疫結(jié)果為SCT的檢出率為19.0%、CCT的檢出率13.3%、IGRA的檢出率為25.3%，見表1。IGRA的檢出率高于SCT、CCT，與石琴等的結(jié)論相符[1]。由于PPD變態(tài)反應是一種遲發(fā)型超敏反應，與機體的健康狀況有關(guān)，體制較差的奶牛反應較慢或者反應強度低。而γ-干擾素ELISA法直接刺激可以檢測結(jié)核病的期感染。用澳大利亞、美國、愛爾蘭、新西蘭、意大利和西班牙的13000頭牛進行田間試驗，結(jié)果表明，在γ-干擾素ELISA法診斷牛結(jié)核病時更敏感，能檢出早期感染牛。

表1 SCT、CCT、IGRA3種牛結(jié)核病檢疫方法比較

2.2 方法符合率

SCT、IGRA、CCT的結(jié)果見表2、表3。

表2 SCT、IGRA二種方法陽性結(jié)果比較

表3 CCT、IGRA二種方法陽性結(jié)果比較

75頭牛中SCT、IGRA共同陽性為7頭，陽性符合率為36.8%(7/19)， 陰性符合率91.0% （51/56）。

CCT、IGRA兩種方法的符合率，75頭牛中共同陽性為7頭，陽性符合率為 36.8%(7/19)，陰性符合率94.6% （53/56）。與陳祥、倪谷音、鄧永強的結(jié)果差異較大[2-4]，差異來源于奶牛體況，試劑盒差異，以及操作規(guī)范性。

CCT與SCT相比，陽性奶牛數(shù)減少2頭，陽性符合率100% （10/10）， 陰性符合率 96.9% （63/65），SCT假陽性率為16.7% （2/12），即采用CCT法可以減少由于禽結(jié)核分枝桿菌造成的假陽性。

3 結(jié)論

（1）3種方法相比，本實驗IGRA的檢出率最高，SCT次之，CCT最低。因此，在奶牛檢疫中，為避免由于禽結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌造成假陽性導致的奶牛誤殺，應采取雙皮試法進行檢疫。另外，鑒于皮內(nèi)變態(tài)反應不能診斷出早期感染的奶牛，對于檢出可疑的奶牛應在3個月內(nèi)復檢，每年開展2次檢疫，對檢出的陽性牛按規(guī)定進行處置，并嚴格按照要求對結(jié)核病陽性牛進行隔離、撲殺，對養(yǎng)殖場進行徹底消毒，堅持自繁自養(yǎng)，經(jīng)過幾年就可以凈化奶牛養(yǎng)殖場結(jié)核病。

（2）γ-干擾素ELISA法能檢出早期感染的奶牛，在體外避免繁瑣操作造成的誤差，可操作性很強。但該法也存在不足之處，即試劑盒價格高，按一個試劑盒做480頭奶牛計算，一頭牛需要試劑費用70元以上，是皮內(nèi)變態(tài)反應的10倍。因此，在采用γ-干擾素ELISA法時，最好先進行雙皮試反應，陽性奶牛再進行采用γ-干擾素ELISA法復查，均為陽性的采取撲殺措施。

（3）本實驗在進行γ-干擾素ELISA時還發(fā)現(xiàn)，該法對檢測人員的熟練操作性要求很強，加樣量和速度快慢、試劑加注、洗板、反應時間等均會影響檢測的重復性。重復性不好時，同一個樣品OD可能大于或小于0.1，造成判斷的誤差。因此，在進行γ-干擾素ELISA法操作時，要嚴格按照操作步驟進行，最好每個樣品做重復。

參考文獻:

[1]石琴,袁立崗,蒲敬偉,等.不同監(jiān)測方法在奶牛結(jié)核病檢疫中的應用[J].中國奶牛,2017(1):33-35：

[2]陳祥,徐正中,時振華,等.γ-干擾素試驗和皮試變態(tài)反應對檢測奶牛結(jié)核病的比較[J].中國人獸共患病學報,2011,27(2):97-100.

[3]倪谷音,毛愛民.γ-干擾素釋放法檢測奶牛結(jié)核病的比較試驗[J].中國動物檢疫,2014(1):64-66

[4]鄧永強,陽愛國,郭莉,等.應用皮內(nèi)變態(tài)反應和γ-干擾素體外釋放試驗檢測奶牛結(jié)核病的比較研究[J].中國奶牛,2014(8):23-25.